スリット走査式顕微鏡によるシナプス小胞の開口放出反応の機構解明

狭缝扫描显微镜下突触小泡胞吐反应的机制

基本信息

批准号：
16790134
负责人：
櫻井孝司
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Hamamatsu University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

平成17年度は当該研究において、1)薄層斜光照明の光学評価、2)インスリン含有小胞やシナプス小胞の追跡、ならびに3)生体内への応用を行った。はじめに薄層光の分布や空間分解能を解析した。幅1ミクロン程度の薄層光を発生させ、ガラス面から3度傾斜させたところ、ガラス面から1ミクロン以内に存在する蛍光分子の信号S/N比が最大となり、単一蛍光分子が解像できた。次に培養海馬神経細胞に標識した蛍光色素(FM1-43)や、グルコース感受性細胞株(MIN6)において強制発現した蛍光タンパク質(insulin-GFP)の追跡を行った。海馬の神経終末において刺激依存的な蛍光強度の上昇が検出でき、直径1〜2ミクロンのスポットが多数観察され、エンドサイトーシス反応を反映していた。MIN6細胞においてインスリン含有顆粒は単一のスポットとして検出され、脱分極依存性に開口放出反応を反映する急激な輝度の変化を示した。開口放出だけでなく、その直前における分泌顆粒の移動や膜への接着も観察できた。以上の結果より、エンドサイトーシス反応やエキソサイトーシス反応における大部分のダイナミクスを薄層斜光照明により解析可能なことが示された。薄層斜光照明法は全反射照明法と同程度の高い空間分解能を保持したまま、共焦点法と同程度の領域における光走査を実現でき、ガラス面より1ミクロン離れた領域において特に有効な手法だと結論した。また、ファイバー法と組み合わせることにより、生体内における分泌小胞の追跡が原理的に可能であることが見出せた。

在2005年，研究包括1）薄层倾斜光照明的光学评估，2）跟踪含胰岛素的囊泡和突触囊泡，以及3）在体内应用。首先，分析了薄层光和空间分辨率的分布。当产生薄薄的光层宽约1微米宽并与玻璃表面倾斜3度时，最大化了玻璃表面1微米内的荧光分子的信号/噪声比，从而最大化了单个荧光分子。接下来，跟踪在培养的海马神经元上标记的荧光染料（FM1-43）和在葡萄糖敏感细胞系中被迫表达的荧光蛋白（胰岛素-GFP）（MIN6）。在海马的神经末端检测到刺激依赖性荧光强度的增加，并且观察到直径为1-2微米的许多斑点，反映了内吞作用反应。在MIN6细胞中检测到含胰岛素的颗粒作为单个位置，显示出亮度突然变化，反映了以去极化依赖性方式的开放释放反应。在观察到此之前，不仅释放开口，而且分泌颗粒的运动和膜的粘附在观察到此之前。以上结果表明，大多数内吞作用和胞吐作用反应的动力学都可以通过薄层倾斜照明来分析。薄层倾斜的光照明可以在类似于共聚焦法的区域中实现光学扫描，同时保持与总反射照明方法相似的高空间分辨率，并且在远离玻璃表面的一个微米的区域中是一种特别有效的方法。此外，当与纤维方法结合使用时，发现原则上可以在体内跟踪分泌囊泡。