スリット走査式顕微鏡によるシナプス小胞の開口放出反応の機構解明

狭缝扫描显微镜下突触小泡胞吐反应的机制

基本信息

批准号：
16790134
负责人：
櫻井孝司
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Hamamatsu University School of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

平成17年度は当該研究において、1)薄層斜光照明の光学評価、2)インスリン含有小胞やシナプス小胞の追跡、ならびに3)生体内への応用を行った。はじめに薄層光の分布や空間分解能を解析した。幅1ミクロン程度の薄層光を発生させ、ガラス面から3度傾斜させたところ、ガラス面から1ミクロン以内に存在する蛍光分子の信号S/N比が最大となり、単一蛍光分子が解像できた。次に培養海馬神経細胞に標識した蛍光色素(FM1-43)や、グルコース感受性細胞株(MIN6)において強制発現した蛍光タンパク質(insulin-GFP)の追跡を行った。海馬の神経終末において刺激依存的な蛍光強度の上昇が検出でき、直径1〜2ミクロンのスポットが多数観察され、エンドサイトーシス反応を反映していた。MIN6細胞においてインスリン含有顆粒は単一のスポットとして検出され、脱分極依存性に開口放出反応を反映する急激な輝度の変化を示した。開口放出だけでなく、その直前における分泌顆粒の移動や膜への接着も観察できた。以上の結果より、エンドサイトーシス反応やエキソサイトーシス反応における大部分のダイナミクスを薄層斜光照明により解析可能なことが示された。薄層斜光照明法は全反射照明法と同程度の高い空間分解能を保持したまま、共焦点法と同程度の領域における光走査を実現でき、ガラス面より1ミクロン離れた領域において特に有効な手法だと結論した。また、ファイバー法と組み合わせることにより、生体内における分泌小胞の追跡が原理的に可能であることが見出せた。

2005年，这项研究涉及1）薄层倾斜照明的光学评估，2）含胰岛素囊泡和突触囊泡的跟踪，以及3）体内应用。首先，我们分析了薄层光分布和空间分辨率。当产生宽度约为1微米的薄层光并与玻璃表面倾斜3度时，距玻璃表面1微米范围内存在的荧光分子的信号信噪比最大化，并且可以实现单个荧光分子的信号信噪比。我能够做到。接下来，我们追踪了标记在培养的海马神经元上的荧光染料 (FM1-43) 和在葡萄糖敏感细胞系 (MIN6) 中强制表达的荧光蛋白 (胰岛素-GFP)。在海马神经末梢检测到刺激依赖性荧光强度增加，并观察到许多直径为 1 至 2 微米的斑点，反映了内吞反应。含有胰岛素的颗粒在 MIN6 细胞中被检测为单个点，并显示出快速的亮度变化，反映了以去极化依赖性方式的胞吐反应。不仅可以观察到胞吐作用，还可以观察到胞吐之前分泌颗粒的运动和对膜的粘附。上述结果表明，胞吞和胞吐反应的大部分动力学可以使用薄层倾斜照明进行分析。薄层倾斜照明方法可以在与共焦方法相当的区域内实现光学扫描，同时保持与全内反射照明方法相当的高空间分辨率，并且在距玻璃1微米的区域特别有效我得出的结论是。此外，我们发现理论上可以通过将该方法与纤维方法相结合来追踪体内的分泌囊泡。