生体分子機械の構造揺らぎと機能発現のメカニズムの解明

阐明生物分子机器的结构波动和功能表达机制

• 批准号: 15710088
• 负责人: 西山 雅祥
• 金额: $ 2.5万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15710088/
• 关键词: 分子モーター; キネシン; 微小管; 高圧力; 蛍光顕微観測; 構造揺らぎ; 1分子計測; 温度変調; 分子モーター; キネシン; 微小管; 高圧力; 蛍光顕微観測; 構造揺らぎ; 1分子計測; 温度変調

タンパク質の天然構造は、数多くの準安定構造との平衡状態にあり、非常に揺らぎやすい性質をもっている。この「柔らかな」立体構造には、タンパク質が機能発現に際して引き起こす大きな構造変化と密接な関わりがあると考えられており、これまでから、高圧NMRなどを用いて、タンパク質構造が大きく揺らぐ部位の同定がなされてきている。研究代表者は、高圧下で生体高分子フィラメントの構造揺らぎを制御しながら、顕微観測を可能にする「高圧力蛍光顕微鏡」を開発した。小型の高圧光学容器(ステンレス製:5.2x5.2x3.4cm)には2つの観測窓が空けてあり、容器内に封入した0.17mlのサンプル溶液を観測できる。観測窓の窓材には、耐圧性と高解像度の顕微観測を両立させるため、厚さ0.5mmのダイヤモンドを採用し光軸方向の厚みをおさえた。この高圧容器を倒立型顕微鏡(IX71, Olympus)にとりつけ、長作動距離の対物レンズ(SLCPlanFl 40x, Olympus)を用いて顕微観測したところ、蛍光染色した微小管の落射蛍光像を観察することに成功した。100MPa(1000気圧)の圧力下で、キネシン-微小管系のin Vitro Motility Assayを行ったところ、滑り運動が20%低下することが明らかになった。今後は、多くのタンパク質が変性しはじめる400MPaの耐圧性をもつ高圧セルを開発すると共に、圧力添加による構造揺らぎと機能発現過程との相関を明らかにする研究を行っていく。

蛋白质的自然结构处于平衡状态，具有许多亚稳态结构，并且具有非常震动的特性。这种“软”三维结构被认为与实现功能表达时蛋白质引起的主要结构变化密切相关，并且使用高压NMR等鉴定出蛋白质结构的位点。研究人员开发了“高压荧光显微镜”，该显微镜可以在高压下控制生物聚合物丝的结构波动时进行显微镜观察。两个观测窗口在一个小的高压光学容器（不锈钢：5.2x5.2x3.4cm）中打开，使您可以观察到包含在容器内部的0.17毫升样品解决方案。观察窗的窗户材料由0.5mm厚的钻石制成，以达到压力抗性和高分辨率微观观察，并且在光轴方向上的厚度降低。该高压容器安装在倒置显微镜上（IX71，Olympus）上，并使用长的工作距离物镜（SLCPlanFL 40X，Olympus）进行显微镜观察，并成功地观察了荧光染色的微管的荧光图像。在100 MPa（1000个气氛）的压力下，驱动蛋白微管的体外运动测定法显示滑动运动降低了20％。将来，我们将开发具有400MPA压力性的高压细胞，许多蛋白质开始变性，我们还将进行研究，以阐明由压力添加引起的结构波动与功能表达过程之间的相关性。