生体分子機械の構造揺らぎと機能発現のメカニズムの解明

阐明生物分子机器的结构波动和功能表达机制

基本信息

批准号：
15710088
负责人：
西山雅祥
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

タンパク質の天然構造は、数多くの準安定構造との平衡状態にあり、非常に揺らぎやすい性質をもっている。この「柔らかな」立体構造には、タンパク質が機能発現に際して引き起こす大きな構造変化と密接な関わりがあると考えられており、これまでから、高圧NMRなどを用いて、タンパク質構造が大きく揺らぐ部位の同定がなされてきている。研究代表者は、高圧下で生体高分子フィラメントの構造揺らぎを制御しながら、顕微観測を可能にする「高圧力蛍光顕微鏡」を開発した。小型の高圧光学容器(ステンレス製:5.2x5.2x3.4cm)には2つの観測窓が空けてあり、容器内に封入した0.17mlのサンプル溶液を観測できる。観測窓の窓材には、耐圧性と高解像度の顕微観測を両立させるため、厚さ0.5mmのダイヤモンドを採用し光軸方向の厚みをおさえた。この高圧容器を倒立型顕微鏡(IX71, Olympus)にとりつけ、長作動距離の対物レンズ(SLCPlanFl 40x, Olympus)を用いて顕微観測したところ、蛍光染色した微小管の落射蛍光像を観察することに成功した。100MPa(1000気圧)の圧力下で、キネシン-微小管系のin Vitro Motility Assayを行ったところ、滑り運動が20%低下することが明らかになった。今後は、多くのタンパク質が変性しはじめる400MPaの耐圧性をもつ高圧セルを開発すると共に、圧力添加による構造揺らぎと機能発現過程との相関を明らかにする研究を行っていく。

蛋白质的天然结构处于平衡状态，有许多亚稳态结构，并且高度不稳定。这种“软”三维结构被认为与蛋白质表达其功能时发生的大结构变化密切相关，我们一直在使用高压核磁共振来识别蛋白质结构发生大波动的位点。主要研究人员开发了一种“高压荧光显微镜”，可以在高压下控制生物聚合物细丝的结构波动的同时进行微观观察。小型高压光学容器（不锈钢材质：5.2x5.2x3.4cm）有两个观察窗，可以观察密封在容器内的0.17ml样品溶液。对于观察窗材料，我们采用了0.5毫米厚的金刚石，以减少光轴方向的厚度，以实现耐压和高分辨率显微观察。当将该高压容器安装到倒置显微镜（IX71，奥林巴斯）并使用长工作距离物镜（SLCPlanFl 40x，奥林巴斯）进行显微镜观察时，我们成功地观察到了荧光染色的微管的落射荧光图像。驱动蛋白-微管系统在 100 MPa（1000 个大气压）压力下的体外运动测定表明，滑动运动减少了 20%。未来，我们将开发一种能够承受400 MPa压力的高压池，在这个压力下，许多蛋白质开始变性，我们还将进行研究，以阐明由于施加压力而引起的结构波动与过程之间的相关性的功能表达。