レーザーを用いたin vivo高度選択的遺伝子導入技術の開発

利用激光开发体内高选择性基因转移技术

基本信息

批准号：
04J07596
负责人：
小倉誠
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

施行条件のさらなる最適化のために、導入遺伝子の量、プロモータの種類、化学的方法との併用等について検討を行なった。実験ではルシフェラーゼ遺伝子をヘアレスラットの皮内にシリンジにて導入した。その結果、導入遺伝子を0.1〜10μgに増加させるに従い、遺CMVプロモータによる遺伝子発現レベルを比較したところ、統計的有意差は見られなかった。またPEIを併用したところ、遺伝子の発現は認められなかった。他の物理的遺伝子導入法と本方法を比較するために、University of California at Santa BarbaraのMitragotri氏のもとで超音波による遺伝子導入実験を行った。実験では周波数20kHzの超音波トランスデューサを用いた。はじめに超音波照射による導入遺伝子の損傷度を調べるために、電気泳動にて超音波適用後のバンドを観察した。その結果、強度が16W/cm^2を超えると、バンドが観察されなくなることがわかった。照射中にバブルが肉眼で観察されたことから、キャビテーションによる導入遺伝子の破壊が示唆された。そこで動物実験では強度0.1〜1.5W/cm^2の超音波を適用した。しかし、ルシフェラーゼ遺伝子をヘアレスラットに導入したところ、いずれの強度においても遺伝子発現レベルはコントロール群と比較して統計的有意差は見られなかった。一般に、生体内では濃度および粘性が比較的高いため、水中に比べキャビテーション閾値が増加すると考えられている。本実験では、ラットの皮内において細胞膜の透過性を亢進させるほどに十分なキャビテーションが得られなかったため、導入遺伝子の発現が見られなかったと推測される。以上の実験条件においてこれらを比較する限り、超音波に比べて本方法が優れていると考えられた。

为了进一步优化执行条件，我们研究了导入基因的量、启动子的类型以及与化学方法的结合。在实验中，使用注射器将荧光素酶基因导入无毛大鼠的皮肤中。结果，当比较随着导入基因从0.1μg增加到10μg由残留CMV启动子引起的基因表达水平时，没有发现统计学上显着的差异。此外，当组合使用PEI时，没有观察到基因表达。为了将该方法与其他物理基因转移方法进行比较，我们与加州大学圣塔芭芭拉分校的 Mitragotri 博士进行了超声波基因转移实验。实验中使用频率为20kHz的超声波换能器。首先，为了检查超声波照射对转基因造成的损伤程度，使用电泳观察超声波照射后的条带。结果发现，当强度超过16W/cm^2时，不再观察到该条带。在照射过程中目视观察到气泡，表明转基因被空化破坏。因此，在动物实验中，施加强度为0.1～1.5W/cm^2的超声波。然而，当将荧光素酶基因引入无毛大鼠时，在任何强度下，与对照组相比，基因表达水平没有统计学上的显着差异。一般认为，与水相比，体内空化阈值增加，因为浓度和粘度相对较高。在该实验中，推测未观察到导入基因的表达，因为未获得足以增加大鼠皮肤内细胞膜的渗透性的空化作用。只要在上述实验条件下进行比较，就认为该方法优于超声波。