一酸化窒素により生じるDNA損傷の遺伝的影響と修復機構の解明

阐明一氧化氮引起的DNA损伤的遗传效应和修复机制

基本信息

批准号：
04J05228
负责人：
中野敏彰
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-04J05228/
关键词：
NO cross-link DNA修復突然変異 Oxanine

项目摘要

一酸化窒素はDNA塩基の脱アミノ化を誘発し、グアニンからはキサンチンとオキザニン(Oxa)が生成する。これまでの研究で、Oxaは生体内物質とクロスリンクし、二次的損傷に変化するとを明らかにした。本研究では、これらの遺伝的影響と修復機構を検討した。まず遺伝的影響を検討するため、Oxaおよびスペルミン(Sp)とクロスリンクしたOxa(Oxa-Sp)を含むオリゴヌクレオチドを鋳型としてin vitroでDNA複製を行い複製が阻害される部位、複製阻害の強さ、損傷部位に取り込まれるヌクレオチドを解析した。OxaおよびOXA-Spは、それぞれ中程度および強い複製阻害効果を示した。Oxaには、dCMPおよびdTMPが1:0.72の効率で取り込まれ、Oxa-SpにはdAMPが低い効率で取り込まれた。よって、Oxaは中程度の致死効果を示すが、損傷乗り越え合成(TLS)が起こるとG:C-A:T transitionを誘発すること、一方Oxa-Spは強い致死効果を示すが、TLSが起こるとG:C-T:A transversionを誘発することが示された。次に修復機構を検討するため、塩基除去修復酵素を用いてOxaに対する除去活性を検討したが、その結果これらのOxaに対する除去活性は極めて弱かった。一方、Oxa-Spに対する活性は用いたすべての塩基除去修復酵素で認められなかった。Oxa-Spはかさ高い損傷であることから、ヌクレオチド除去修復(NER)機構により修復される可能性が高い。そこで、UvrABCヌクレアーゼおよび細胞粗抽出物を用いて、Oxa-Spに対するNER切断活性を検討した。Oxaを含む基質は切断されなかったが、Oxa-Sp含む基質は効率良く切断され、Oxa-SpがNER機構により修復されることが明らかとなった。

一氧化氮诱导 DNA 碱基脱氨，鸟嘌呤生成黄嘌呤和恶嘌呤 (Oxa)。先前的研究表明，Oxa 与生物物质交联并造成二次损伤。在这项研究中，我们研究了这些遗传影响和修复机制。首先，为了检查遗传效应，我们使用含有Oxa和精胺（Sp）交联的Oxa（Oxa-Sp）的寡核苷酸作为模板进行体外DNA复制，以确定复制被抑制的位点和复制抑制的强度现在，我们分析了掺入受损位点的核苷酸。 Oxa 和 OXA-Sp 分别表现出中度和强的复制抑制作用。 dCMP和dTMP掺入Oxa的效率为1:0.72，dAMP掺入Oxa-Sp的效率较低。因此，Oxa具有中等致死作用，但当TLS发生时，它诱导G:C-A:T转变，而Oxa-Sp具有强致死作用，但当TLS发生时，它诱导G:C-A:T转变。被证明可以诱导 :C-T:A 颠换。接下来，为了检查修复机制，我们使用碱基切除修复酶研究了对 Oxa 的去除活性，但结果，对 Oxa 的去除活性极弱。另一方面，在所使用的任何碱基切除修复酶中均未观察到针对 Oxa-Sp 的活性。由于 Oxa-Sp 是一个大的病变，它很可能通过核苷酸切除修复（NER）机制进行修复。因此，我们使用 UvrABC 核酸酶和粗细胞提取物研究了针对 Oxa-Sp 的 NER 裂解活性。虽然含有Oxa的底物没有被裂解，但含有Oxa-Sp的底物被有效裂解，表明Oxa-Sp通过NER机制被修复。