SKP2siRNAを用いたp27タンパク分解抑制による制癌効果

使用SKP2siRNA抑制p27蛋白降解的抗癌作用

基本信息

批准号：
15791043
负责人：
工藤保誠
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

p27^<Kip1>タンパクの発現低下は、口腔扁平上皮癌において高頻度に認められ、その発現低下には、翻訳後の異常なタンパク分解によるものと考えられている。最近、p27^<Kip1>のタンパク分解には、ユビキチンリガーゼであるSkp2によりユビキチン化され、プロテアソームにより分解されることが明らかになった。我々は、口腔扁平上皮癌におけるSkp2の過剰発現が、高頻度にみられ、p27の分解とよく相関することをすでに見いだしていることから、本研究では、Skp2の発現をsiRNAにより抑制し、p27^<Kip1>タンパク分解を阻害することによる制癌効果を調べ、遺伝子治療への応用の可能性について検討した。我々は、p27タンパクの異常分解により発現が低く、Skp2の発現の高いOSCCC細胞株であるHSC3細胞およびSkp2の発現が低く、p27タンパクの発現の高いHSC4細胞を本研究に用いた。Skp2特異的なsiRNAを発現するベクターを作製し、HSC3およびHSC4細胞に遺伝子導入し、Skp2の発現抑制をwestern blotにより確認した。Skp2発現の抑制がみられた細胞では、p27タンパクの発現の増加がみられ、増殖能の低下が認められた。特に、p27タンパクの過剰な分解がみられるHSC3細胞において、強い増殖抑制効果が認められた。さらに、Cychroheximideを処理し、タンパクの半減期を検討したところ、分解の抑制がみられ、Cdk2キナーゼ活性の低下も認められ、p27発現の増加による増殖抑制効果が確認された。次に、Skp2 siRNA導入細胞をヌードマウスに移植し、in vivoにおける増殖抑制効果を検討したところ、Skp2 siRNA導入細胞では、コントロールに比べて、腫瘍サイズが40%減少し、組織学的にもコントロール群が腫瘍辺縁部において浸潤性に増殖していたのに対し、Skp2 siRNA導入群では被膜に覆われており、腫瘍中心部が広範に角化壊死に陥っていた。以上の結果より、Skp2 siRNA遺伝子導入は、p27タンパクの分解を抑制することにより、口腔扁平上皮癌細胞のin vitroおよびin vivoにおける増殖を抑制することが明らかになり、我々が目的とするp27タンパクの分解抑制をターゲットとした新たな治療法の一つになりうることが示唆された。

在口服鳞状细胞癌中经常观察到p27^<kip1>蛋白的表达降低，并且表达降低被认为是由于翻译后异常降解引起的。最近，已经揭示了p27^<kip1>的蛋白水解是通过泛素连接酶SKP2实现的，并被蛋白酶体降解。由于我们已经发现SKP2在口服鳞状细胞癌中的过表达非常普遍，并且与p27降解良好相关，因此在这项研究中，我们研究了抑制siRNA抑制SKP2表达并抑制p27^<kip1>蛋白质蛋白去分解的抗癌作用，并检查了潜在的基因疗法。由于p27蛋白质异常降解，OSCCC细胞系的低表达，SKP2的高表达以及p27蛋白的高表达，我们使用了表达不良的HSC4细胞。制备了表达SKP2特异性siRNA的载体，并将基因转移到HSC3和HSC4细胞中，并通过Western blot证实了SKP2表达的抑制。在抑制SKP2表达的细胞中，观察到p27蛋白的表达增加，观察到增殖能力的降低。特别是，在观察到p27蛋白过度降解的HSC3细胞中观察到了强生长抑制作用。此外，当治疗Cychroheximide并检查了蛋白质的半衰期时，发现降解被抑制，并且CDK2激酶活性也降低，并通过增加P27表达来确认生长抑制作用。接下来，将SKP2 siRNA转导的细胞植入裸鼠中，并在体内研究生长抑制作用。与对照组相比，SKP2 siRNA转移的细胞表明，肿瘤大小减少了40％，并且在组织学上，对照组在肿瘤边缘浸润性呈侵入性，而SKP2 siRNA siRNA转导的组则被胶囊覆盖，从而导致肿瘤中心的角化蛋白化坏死。以上结果表明，SKP2 siRNA基因转移抑制了p27蛋白的降解，从而抑制了体外和体内口服鳞状细胞癌细胞的生长，这表明我们可能是针对p27蛋白质降解的新治疗方法之一。