SKP2siRNAを用いたp27タンパク分解抑制による制癌効果

使用SKP2siRNA抑制p27蛋白降解的抗癌作用

基本信息

批准号：
15791043
负责人：
工藤保誠
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

p27^<Kip1>タンパクの発現低下は、口腔扁平上皮癌において高頻度に認められ、その発現低下には、翻訳後の異常なタンパク分解によるものと考えられている。最近、p27^<Kip1>のタンパク分解には、ユビキチンリガーゼであるSkp2によりユビキチン化され、プロテアソームにより分解されることが明らかになった。我々は、口腔扁平上皮癌におけるSkp2の過剰発現が、高頻度にみられ、p27の分解とよく相関することをすでに見いだしていることから、本研究では、Skp2の発現をsiRNAにより抑制し、p27^<Kip1>タンパク分解を阻害することによる制癌効果を調べ、遺伝子治療への応用の可能性について検討した。我々は、p27タンパクの異常分解により発現が低く、Skp2の発現の高いOSCCC細胞株であるHSC3細胞およびSkp2の発現が低く、p27タンパクの発現の高いHSC4細胞を本研究に用いた。Skp2特異的なsiRNAを発現するベクターを作製し、HSC3およびHSC4細胞に遺伝子導入し、Skp2の発現抑制をwestern blotにより確認した。Skp2発現の抑制がみられた細胞では、p27タンパクの発現の増加がみられ、増殖能の低下が認められた。特に、p27タンパクの過剰な分解がみられるHSC3細胞において、強い増殖抑制効果が認められた。さらに、Cychroheximideを処理し、タンパクの半減期を検討したところ、分解の抑制がみられ、Cdk2キナーゼ活性の低下も認められ、p27発現の増加による増殖抑制効果が確認された。次に、Skp2 siRNA導入細胞をヌードマウスに移植し、in vivoにおける増殖抑制効果を検討したところ、Skp2 siRNA導入細胞では、コントロールに比べて、腫瘍サイズが40%減少し、組織学的にもコントロール群が腫瘍辺縁部において浸潤性に増殖していたのに対し、Skp2 siRNA導入群では被膜に覆われており、腫瘍中心部が広範に角化壊死に陥っていた。以上の結果より、Skp2 siRNA遺伝子導入は、p27タンパクの分解を抑制することにより、口腔扁平上皮癌細胞のin vitroおよびin vivoにおける増殖を抑制することが明らかになり、我々が目的とするp27タンパクの分解抑制をターゲットとした新たな治療法の一つになりうることが示唆された。

在口腔鳞状细胞癌中经常观察到p27^<Kip1>蛋白表达降低，并且这种表达降低被认为是由于异常翻译后蛋白降解所致。最近，研究表明p27^<Kip1>被泛素连接酶Skp2泛素化并被蛋白酶体降解。我们已经发现，口腔鳞状细胞癌中频繁观察到 Skp2 的过表达，并且与 p27 降解有很好的相关性。在本研究中，我们用 siRNA 抑制 Skp2 表达，并研究了抑制蛋白质降解的抗癌作用，并研究了研究了应用于基因治疗的可能性。本研究中我们使用了HSC3细胞、由于p27蛋白异常降解而导致Skp2低表达和Skp2高表达的OSCCC细胞系，以及Skp2低表达和p27蛋白高表达的HSC4细胞。创建表达Skp2特异性siRNA的载体，将该基因导入HSC3和HSC4细胞，并通过蛋白质印迹证实Skp2表达的抑制。在Skp2表达受到抑制的细胞中，p27蛋白表达增加，增殖能力下降。特别是，在 HSC3 细胞中观察到强烈的生长抑制作用，其中观察到 p27 蛋白过度降解。此外，当用放线菌酮处理蛋白质并检查蛋白质的半衰期时，降解受到抑制，Cdk2激酶活性也降低，证实了由于p27表达增加而产生的生长抑制作用。接下来，我们将Skp2 siRNA转染的细胞移植到裸鼠体内，并在体内检测其生长抑制效果。在Skp2 siRNA转染的细胞中，与对照相比，肿瘤尺寸减小了40%，并且从组织学上看，肿瘤尺寸也减小了。相反，在Skp2 siRNA导入组中，肿瘤被包膜覆盖，并且肿瘤中心广泛角化和坏死。从以上结果可以清楚地看出，Skp2 siRNA基因的导入通过抑制p27蛋白的降解来抑制体外和体内口腔鳞状细胞癌细胞的增殖，这表明这可能是一种新的抑制方法。治疗方法以抑制分解为目标。