ビデオマイクロスコピーによる破骨細胞の酸分泌機能解析

视频显微镜分析破骨细胞的酸分泌功能

• 批准号: 15790788
• 负责人: 星野 裕信
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Hamamatsu University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15790788/
• 关键词: 破骨細胞; ビデオマイクロスコピー; 微分干渉顕微鏡; 酸分泌; リン酸カルシウム; VEC-DIC

今回の研究により明視野顕微鏡観察下で破骨細胞が十分な酸分泌活性を示すような培養条件を確立した。酸分泌機能を可視化するために、リン酸カルシウムをコートしたカバーガラス上での培養を行ったところ、活発に骨吸収を行っている破骨細胞内では、核は偏在し、酸分泌を示唆すると思われる多数の空胞が出現することを確認できた。またビデオマイクロスコピーの手法を用いることにより、破骨細胞がリン酸カルシウムを吸収する様子を高解像度で動画記録できた。それにより破骨細胞の骨吸収能における新しい知見が得られた。方法は、2-8日齢の日本白色家兎の四肢長管骨より単離した成熟破骨細胞をリン酸カルシウムをコートしたカバーガラス上で培養し、100倍対物レンズを使用したビデオ強化型微分干渉顕微鏡にて、タイムラプス撮影(3秒間隔、60分間)を行った。これが破骨細胞であることは免疫染色法により確認した。その結果、破骨細胞の細胞底面の波状縁と考えられる突起が活発に動き、徐々に吸収窩を形成する様子が観察され、また細胞辺縁部の偽足様突起がコートされたリン酸カルシウムを機械的に破壊する様子が記録できた。これを画像解析することにより、破骨細胞活性を定量化する手法を確立できた。これまで破骨細胞による骨のミネラル成分の溶解は酸による溶解(化学的骨破壊)のみ論じられてきたが、波状縁または偽足様突起による機械的作用(物理的骨破壊)も関与していることが推察された。また、破骨細胞の活性を高めるためにヒスタミン刺激を行った結果、破骨細胞がより活発に吸収窩を形成する様子が観察され、ヒスタミン非刺激群と比較して、有意に吸収窩形成速度が上昇していた。この手法を用いれば、骨吸収に影響を与える薬物の影響を分子レベルでリアルタイムに定量評価可能になると思われる。

通过这项研究，我们建立了使破骨细胞在明视野显微镜下表现出足够的酸分泌活性的培养条件。为了使酸分泌功能可视化，我们在涂有磷酸钙的盖玻片上进行培养，发现细胞核在积极吸收骨的破骨细胞内分布不均匀，这表明酸分泌已证实出现了许多空泡。此外，通过使用视频显微镜，我们能够记录破骨细胞吸收磷酸钙的高分辨率视频。结果，获得了关于破骨细胞骨吸收能力的新发现。该方法包括在磷酸钙涂层盖玻片上培养从 2-8 天大的日本白兔的长肢骨中分离出的成熟破骨细胞，并使用 100 倍物镜进行视频增强微分干涉。 （3秒间隔，60分钟）使用显微镜进行。通过免疫染色证实这些是破骨细胞。结果，观察到破骨细胞细胞底部的被认为是波状边缘的突起活跃地移动并逐渐形成吸收凹坑，并且细胞边缘的伪足状突起机械地吸收包被的磷酸钙。我能够记录破坏情况。通过分析该图像，我们能够建立一种量化破骨细胞活性的方法。迄今为止，仅通过酸溶解（化学性骨破坏）讨论了破骨细胞对骨矿物成分的溶解，但也假设存在通过波状边缘或伪足突起的机械作用（物理性骨破坏）。此外，由于组胺刺激增加了破骨细胞的活性，观察到破骨细胞更活跃地形成吸收坑，并且吸收坑形成率显着高于非组胺刺激组。利用这种方法，将有可能在分子水平上实时定量评估影响骨吸收的药物的效果。