核膜透過過程の新規定量化システムの構築と核膜輸送の基質認識性、機能多様性の解析

新型核膜渗透过程定量体系的构建及核膜转运底物识别和功能多样性分析

基本信息

批准号：
15790084
负责人：
秋田英万
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

遺伝子ベクターを最適化する上で、エンドソームから細胞質への脱出と、それに引き続く核膜透過過程の効率を定量化する事は重要である.本研究においては、共焦点レーザー顕微鏡により得られる画像を基に定量化を試み、細胞内動態の定量的解析法を構築した。さらに、PCRを用いて、核内への遺伝子到達量を測定する系についても確立し、これらを用いて各種遺伝子導入法の違いによる細胞内遺伝子動態の比較を行った。stearyl R8及びlipofectAMINEによる導入時においては、R8と比較してendosome/lysosomeからの脱出過程とそれに伴う核内移行過程が非常に早い事が明らかとなり、遺伝子発現活性と矛盾をしない結果となった。また、stearyl R8を用いた導入においては、エンドソームの脱出とそれに続く核膜透過が時間依存的に上昇するのに対し、lipofectAMINEを用いた際には、特に30分という非常に早い時間で細胞質や核に遺伝子が移行する事が明らかとなり、エンドサイトーシス以外の経路を介した取込み機構の存在と、効率的な核移行性が示唆された。このような細胞内遺伝子定量解析は、遺伝子ベクターの新たな細胞内挙動メカニズムを明らかにするのみでなく、核指向性新規遺伝子ベクターの開発に有用であろうと考えられる。現在、この実験系を用い、より究極的な課題として、なぜウイルスは人工ベクターと比較して遺伝子発現が悪いのかを細胞内動態の観点から明らかにする事を試みている.

在优化基因载体时，重要的是要量化从内体到细胞质的逃逸效率和随后的核膜渗透过程。在这项研究中，根据共焦激光显微镜获得的图像进行了定量，并构建了细胞内动力学的定量分析。此外，还使用PCR建立了用于测量到达细胞核基因量的系统，并且使用这些系统，根据各种基因转移方法的差异比较细胞内基因动力学。当用硬脂基R8和Lipofectamine引入时，很明显，与R8相比，内体/溶酶体和相关的核易位过程的逃生过程非常快，导致与基因表达活性无矛盾。此外，在引入中，使用稳固的R8，内体逃逸和随后的核渗透在时间依赖性方式中增加，而当使用脂肪切开胺时，将基因转移到30分钟的早期细胞质和细胞核中，这表明通过摄取机制的存在通过PATH的存在，而不是其他外核核电易于且有效的核核电。对细胞内基因的这种定量分析被认为不仅可用于阐明基因载体的细胞内行为的新机制，而且对于新型核指导基因载体的发展也是有用的。目前，使用此实验系统，我们试图将病毒与人工媒介相比，从细胞内动力学的角度来看，病毒表达病毒表达较差，为何阐明，为什么病毒表达较差。