有機アニオン輸送体発現系を利用した医薬品の胆汁排泄、黄疸誘発性の種差評価系の確立

利用有机阴离子转运蛋白表达系统建立药物胆汁排泄及黄疸诱导物种差异评价体系

• 批准号: 15790085
• 负责人: 伊藤 晃成
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15790085/
• 关键词: Mrp2; 胆汁排泄; 種差; 黄疸

医薬品開発過程での毒性評価はしばしばイヌやサルなどの大動物においても行われるが、ラットやマウスなどの小動物と比較してその遺伝子情報および遺伝子産物の機能に関する情報も十分ではない。毒性ターゲットとなりうる蛋白分子の機能解析は実験動物においてもなされるべきであり、これにより毒性発現の分子機構解明が加速されるはずである。また毒性ターゲット分子が既知の場合、動物実験に代替してヒト或いは動物の遺伝子を用いたin vitro発現系の利用が可能である。今年度はH15年度に引き続きマウス、サルのMrp2の機能発現系の作製と評価を行った。BALB/cマウスおよびカニクイザル肝臓cDNAよりPCRクローニングされた遺伝子はデータベースに報告されたものと比較し、いくつかのアミノ酸変異を伴うSNPsを有していた。この遺伝子産物の機能をバキュロウィルス発現系で測定した。両種のMrp2はこれまで知られているラット、ウサギ、イヌ、ヒトMrp2同様に有機アニオン性化合物の輸送活性を有することが示されたが、興味深いことに蛋白一分子当たりのグルタチオン抱合体の輸送活性、すなわち固有輸送活性がラットやイヌに比較して顕著に大きかった。またグルクロン酸抱合体に対する親和性がラットやイヌに比較して極めて低いことが明らかとなり、Mrp2分子当たりの輸送活性、基質への親和性に大きな種差があることが明らかとなった。標準抗原を用いたWestern解析より、マウスとサルの肝臓におけるMrp2蛋白発現量はラットのそれぞれ3分の1、10分の1と見積もられた。Mrp2の質的、量的違いのうち、ラット、マウス、イヌ、サルで過去に報告されていた薬物胆汁排泄能力の差は主にMrp2蛋白発現量の違いでほぼ説明可能であることが示された。一方阻害親和性に見られた大きな種差は薬物による黄疸誘発性の種差がありうることを改めて示すものであり、本研究で得られた一連のMrp2発現系はこれらを簡便にスクリーニングするツールとして応用可能と思われる。

尽管在狗和猴子等大型动物中通常进行了药物开发过程中的毒性评估，但与大鼠和小鼠等小动物相比，关于其基因产物的遗传信息和功能的信息也不足。还应在实验动物中对可能是有毒靶标的蛋白质分子的功能分析，这应该加速阐明毒性发展的分子机制。此外，如果已知有毒靶标分子，则可以使用人类或动物基因的体外表达系统代替动物实验。今年，与2013财年一样，我们在小鼠和猴子中创建并评估了MRP2的功能表达系统。与数据库中报道的基因相比，基因从BALB/C小鼠和Cynomolgus猴子肝脏cDNA克隆PCR具有几种氨基酸突变。使用杆状病毒表达系统测量该基因产物的功能。两种MRP2物种均已证明具有有机阴离子化合物的转运活性，类似于先前已知的大鼠，兔子，狗和人MRP2，但有趣的是，谷胱甘肽结合物的每个蛋白质分子的转运活性，即固有的转运活性，比大鼠和狗的固有性转运活性大。还表明，与大鼠和狗相比，对葡萄糖醛酸苷结合物的亲和力极低，并且每个MRP2分子的传输活性存在很大的物种差异，并且对底物的亲和力。使用标准抗原的西方分析估计，小鼠和猴肝中的MRP2蛋白表达水平分别为大鼠的三分之一和十分之一。在MRP2的定性和定量差异中，可以证明，以前报道的大鼠，小鼠，狗和猴子的药物胆汁排泄能力的差异主要通过MRP2蛋白表达水平的差异来解释。另一方面，在抑制性亲和力中看到的很大的物种差异是一种重申，可以将药物诱导的物种差异是黄疸诱导的物种，并且在这项研究中获得的一系列MRP2表达系统可以用作轻松筛选这些物种。

项目成果

Ito, K., T.Koresawa, K.Nakano, T.Horie: "Mrp2 is involved in benzylpenicillin-induced choleresis"Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. (In press). (2004)

Ito, K.、T.Koresawa、K.Nakano、T.Horie：“Mrp2 参与青霉素诱导的胆汁收缩”Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol。

Ji, B., K.Ito, T.Horie.: "Multidrug Resistance-Associated Protein 2 (MRP2) Enhances 4-Hydroxynonenal-Induced Toxicity in Madin-Darby Canine Kidney II Cells"Chem Res Toxicol. 17. 158-164 (2004)

Ji, B., K.Ito, T.Horie.：“多药耐药性相关蛋白 2 (MRP2) 增强 Madin-Darby 犬肾 II 细胞中 4-羟基壬烯醛诱导的毒性”Chem Res Toxicol。

Li, T., K.Ito, T.Horie.: "Transport of fluorescein methotrexate by multidrug resistance-associated protein 3 in IEC-6 cells"Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 285. G602-G610 (2003)

Li, T., K.Ito, T.Horie.：“IEC-6 细胞中多药耐药相关蛋白 3 转运荧光素甲氨蝶呤”Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol。

Ikegami, N.Tanaka, H.Akita, K.Ito, H.Suzuki, Y.Sugiyama: "Genipin enhances Mrp2 (Abcc2)-mediated bile formation and organic anion transport in rat liver"Hepatology. 39. 167-178 (2004)

Ikegami、N.Tanaka、H.Akita、K.Ito、H.Suzuki、Y.Sugiyama：“京尼平增强大鼠肝脏中 Mrp2 (Abcc2) 介导的胆汁形成和有机阴离子转运”肝病学。

Li, T., T.Tomimatsu, K.Ito, T.Horie.: "Fluorescein-methotrexate transport in brush border membrane vesicles from rat small intestine"Life Sci. 73. 2631-2639 (2003)

Li，T.，T.Tomimatsu，K.Ito，T.Horie.：“荧光素-甲氨蝶呤在大鼠小肠刷状缘膜囊泡中的转运”生命科学。