哺乳動物における相同組み換えタンパク(RAD51)の分子機能の解析

哺乳动物同源重组蛋白（RAD51）的分子功能分析

• 批准号: 15770113
• 负责人: 吉田 佳世
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Osaka City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15770113/
• 关键词: 相同組換え; Rad51遺伝子; 放射線感受性; 細胞増殖; 相同組換え; Rad51遺伝子; 放射線感受性; 細胞増殖

生物を取り巻く環境の中には、電離放射線、紫外線のようなDNAに損傷を及ぼす変異原が存在するため、生物には遺伝情報を安定に保持する機構が備わっている。特に、DNA二重鎖切断を受けたときに、もう一方の相同なDNAを鋳型として組換えにより修復する相同組換えは、遺伝情報の正確な維持だけでなく、減数分裂期における遺伝的多様性の形成にも重要な役割を果たしていると考えられる。このような相同組換えに関与する遺伝子として、真核生物には大腸菌RecA遺伝子のホモログであるRad51遺伝子が存在する。近年、RAD51タンパクは癌抑制遺伝子産物や細胞周期チェックポイントタンパクと結合していることが明らかになり、哺乳動物細胞の組換えタンパクには、DNAが二重鎖切断を受けた場合、組換え修復を行うと同時に、細胞そのものの増殖を停止し個体を守る機能があると考えられる。Rad51遺伝子は、細胞増殖に必須であるため、Rad51遺伝子をテトラサイクリン依存性に発現制御できるターゲティングベクターを構築し、ターゲティングベクターをマウスES細胞及びF9細胞に導入し、ヘテロの相同組換え体を得た。内在性Rad51遺伝子の発現をドキシサイクリンにより抑制できることをノーザン、ウェスタン法で確認した。さらに、ヘテロの相同組換え体(ES細胞)からキメラマウスを作製したが、germ lineキメラは得られなかった。そこで、ピューロマイシン耐性遺伝子を含むターゲティングベクターを新たに構築した。現在、このターゲティングベクターをヘテロの相同組換え体に導入し、ホモの相同組換え体を作成中である。今後、ホモの相同組換え体を用いて、外部から種々の変異RAD51組換えタンパクを導入することにより、放射線感受性、細胞増殖性などの影響を解析し、必要なドメインを決定する予定である。

周围生物体的环境具有损伤DNA的诱变剂，例如电离辐射和紫外线，生物体具有稳定维持遗传信息的机制。特别是，在经历DNA双链断裂时将其他同源DNA重组为模板的同源重组不仅在遗传信息的精确维持中起着重要作用，而且在减血过程中遗传多样性的形成中也起着重要作用。作为参与此类同源重组的基因，真核生物包括大肠杆菌RECA基因的同源物的Rad51基因。近年来，已经揭示了RAD51蛋白与癌症抑制基因产物和细胞周期检查点蛋白的约束，并且人们认为，哺乳动物细胞中的重组蛋白具有在DNA经历双链破裂的同时停止细胞自身和保护个体的扩散时进行重新组合修复的功能。由于Rad51基因对于细胞增殖至关重要，因此构建了能够以四环素依赖性方式控制Rad51基因表达的靶向载体，并将靶向载体引入小鼠ES细胞和F9细胞中以获得异源同源重组剂。北部和西方方法证实了内源性rad51基因的表达可以被强力霉素抑制。此外，由异源同源重组（ES）制备嵌合小鼠，但没有获得生殖系嵌合体。因此，构建了一个含有嘌呤霉素抗性基因的新靶向载体。当前，该靶向矢量正在引入异质同源重组，以产生同源重组。将来，我们计划使用同源同源重组因子从外部引入各种突变体Rad51重组蛋白，并分析辐射敏感性和细胞增殖的效果，并确定所需的域。