Na^+/H^+交換輸送蛋白質NhaAのpHセンサーおよびイオン交換輸送機構の解析

Na^+/H^+交换转运蛋白NhaA的pH传感器及离子交换转运机制分析

• 批准号: 15770086
• 负责人: 井上 弘樹
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-15770086/
• 关键词: NhaA; イオン輸送; pH依存性; ナトリウムイオン; H.pylori; 大腸菌; システイン走査変異法; 精製 再構成

Na^+/H^+交換輸送蛋白質は細菌から高等動植物まで生物に広く存在し,細胞膜内外のNa^+とH^+を交換輸送することにより細胞内pHやNa^+濃度を調節する極めて重要な因子である。Na^+/H^+交換輸送蛋白質は推定アミノ酸一次配列の比較からいくつかのタイプに分類できるが,NhaAと呼ばれるタイプの輸送蛋白質は大腸菌を初め多く細菌から見出されており,アルカリpHで強く活性化を受ける。一方,H.pyloriのNhaA(HP NhaA)は他の細菌のNhaAと高い相同性を有しているにもかかわらず,pHによらず高い活性を有している。本研究で行ったHP NhaAに対するランダム変異導入による解析から,pH応答性には第4,8,10膜貫通領域(TM4,8,10)が,また基本的なイオン交換輸送活性にはTM4,5,10,11が深く寄与していることが明らかとなった。さらに,私は,イオン輸送とpH応答性の双方に関与するTM4領域についてシステイン走査変異法とN-ethylmaleimideによる修飾実験を行い,TM4領域がNhaA分子内で親水性の小孔の一部を形成していることを強く示唆するデータを得た。また,TM4が形成する親水性小孔の上端部には,疎水的な脂質膜貫通領域中に唯一存在する極性残基であるThr,Asp残基が存在しており,変異体のKm,Vmax値の変化からこれら残基がNa^+の結合部位の一部となっていることが明らかにした。一方で,HP NhaAの大腸菌内での大量発現・精製系,およびリポソームへの再構成系を構築した。この系を用い,HP NhaAについて速度論的解析およびpH依存性に関する詳細な検討を現在進行中である。

Na^+/H^+交换转运蛋白广泛存在于从细菌到高等动植物的生物体中，是通过交换和转运Na^+和H^来调节细胞内pH和Na^+浓度的极其重要的分子+ 细胞膜内外这是一个重要因素。 Na^+/H^+交换转运蛋白根据其估计的一级氨基酸序列的比较可以分为几种类型，并且在许多细菌中发现了一种称为NhaA的转运蛋白，包括大肠杆菌和在碱性 pH 值下稳定。另一方面，幽门螺杆菌的NhaA（HP NhaA）虽然与其他细菌的NhaA具有高度同源性，但无论pH如何，它都具有高活性。本研究通过在 HP NhaA 中引入随机突变进行的分析表明，第 4、第 8 和第 10 跨膜结构域（TM4、8、10）负责 pH 响应性，而 TM4 和 TM4 负责基本离子交换转运活性。很明显，5、10 和 11 做出了深远的贡献。此外，我对涉及离子传输和pH响应性的TM4区域进行了半胱氨酸扫描诱变和N-乙基马来酰亚胺修饰实验，发现TM4区域形成了NhaA分子内亲水孔的一部分。我们获得的数据强烈表明情况确实如此。此外，疏水性脂质跨膜区域中存在的唯一极性残基Thr和Asp残基存在于TM4形成的亲水性孔的上端，并且突变体的Km和Vmax存在变化。这些值表明这些残基是Na^+结合位点的一部分。另一方面，我们构建了HP NhaA在大肠杆菌中的大规模表达和纯化系统，以及将其重构为脂质体的系统。目前正在进行使用该系统进行 HP NhaA 的动力学分析和 pH 依赖性的详细研究。

项目成果

Tsuboi, Y., Inoue, H., Nakamura, N., Kanazawa, H.: "Identification of membrane domains of the Na+/H+ antiporter(NhaA)Protein from Helicobacter pylori required for ion transport and pH sensing."J.Biol.Chem.. 278. 21467-21473 (2003)

Tsuboi, Y.、Inoue, H.、Nakamura, N.、Kanazawa, H.：“幽门螺杆菌中离子转运和 pH 传感所需的 Na /H 反向转运蛋白 (NhaA) 蛋白膜域的鉴定。”J.Biol

Mitsui, K., Ochi, F., Nakamura, N., Doi, Y., Inoue, H., Kanazawa H.: "A novel membrane protein capable of binding the Na+/H+ antiporter(Nha1p)enhances the salinity-resistant cell growth of Saccharomyces cerevisiae."J.Biol.Chem.. in press. (2004)

Mitsui, K.、Ochi, F.、Nakamura, N.、Doi, Y.、Inoue, H.、Kanazawa H.：“一种能够结合 Na /H 反向转运蛋白 (Nha1p) 的新型膜蛋白可增强抗盐性

Mitsui, K., Kamauchi, S., Nakamura, N., Inoue, H., Kanazawa, H: "A Conserved Domain in the Tail Region of the Saccharomyces cerevisiae Na+/H+ Antiporter(Nha1p) Plays Important Roles in Localization and Salinity-Resistant Cell-Growth."J.Biochem.(Tokyo). 13

Mitsui, K.、Kamauchi, S.、Nakamura, N.、Inoue, H.、Kanazawa, H：“酿酒酵母 Na /H 反转运蛋白 (Nha1p) 尾部区域的保守域在定位和盐度中发挥重要作用

Kuwahara, H., Kamei, J., Nakamura, N., Matsumoto, M., Inoue, H., Kanazawa, H.: "The apoptosis-inducing protein kinase DRAK2 is inhibited in a calcium-dependent manner by the calcium-binding protein CHP."J.BIochem.(Tokyo). 134. 245-250 (2003)

Kuwahara, H.、Kamei, J.、Nakamura, N.、Matsumoto, M.、Inoue, H.、Kanazawa, H.：“细胞凋亡诱导蛋白激酶 DRAK2 以钙依赖性方式被钙-

Inoue, H., Nakamura, Y., Nagita, H., Takai, T., Masuda.M., Nakamura, N., Kanazawa, H.: "Calcineurin Homologous Protein Isoform 2(CHP2), Na^+/H^+ Exchangers--Binding Protein, Is Expressed in Intestinal Epithelium."Biol.Pharm.Bull.. 26. 148-155 (2003)

Inoue, H.、Nakamura, Y.、Nagita, H.、Takai, T.、Masuda.M.、Nakamura, N.、Kanazawa, H.：“钙调神经磷酸酶同源蛋白亚型 2(CHP2)，Na^ /H^