細胞周期制御分子を用いた造血幹細胞の体外増幅の試み

尝试利用细胞周期控制分子体外扩增造血干细胞

• 批准号: 03J61556
• 负责人: 佐藤 友亮
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J61556/
• 关键词: 造血幹細胞; 自己複製; 細胞周期; c-Myc; 細胞周期制御分子

本研究では、造血幹細胞の自己複製における細胞周期制御分子の役割に注目し、以下の研究を行った。これまで、Notch1,HOXB4といった分子が造血幹細胞の自己複製を促すことが報告されていることから、まずはじめに、マウスLin^-Sca-1^+細胞に、4-hydroxytamoxifen(4-HT)によってNotch1活性が誘導されるNotch1/ERTとHOXB4をレトロウイルスを用いて導入し、各種の解析を行った。Notch1/ERT導入細胞は、4-HT非存在下では、SCF、FLT3L、IL-6などのサイトカイン存在下でも14日以上増殖できなかったのに対し、4-HT存在下では14日以上増殖を続けた。同様に、Mockベクター導入細胞は各種のサイトカイン存在下でも14日以上増殖できなかったのに対し、HOXB4導入細胞は同様の条件下で14日以上増殖した。培養7日目の細胞周期制御分子の発現を半定量的RT-PCR法によって解析したところ、Notch1およびHOXB4の発現を誘導した細胞では、c-myc, cyclin D2,D3,EおよびE2F1の発現上昇が認められた。他の細胞種において、c-Mycは単独で細胞増殖を誘導することが報告されていることから、4-HTによりc-Mycの活性が誘導されるMyc/ERTをマウスLin^-Sca-1^+細胞に導入し、SCF、FLT3L、IL-6などのサイトカイン存在下で培養した。Myc/ERT導入細胞は4-HT添加時のみ未分化な表面形質を保持した状態で28日以上増殖した。また、コロニー形成能とテロメレース活性の上昇が認められた。次に、Myc/ERT導入細胞の生体内での機能を評価する目的で、移植実験を行った。その結果、Myc/ERTで増幅した細胞は6ヶ月以上にわたり、骨髄単球系、B細胞系、T細胞系の3血球系統の造血を支持した。更にNotch1,HOXB4がc-mycプロモーターを活性化すること、およびNotchシグナルによってc-mycプロモーター内の-195から-161の領域にDNA結合蛋白が形成されることが、明らかとなった。以上の結果より、細胞周期制御分子c-MycはNotch, HOXB4の下流で造血幹細胞の自己複製を促すと推測された。

本研究围绕细胞周期调控分子在造血干细胞自我更新中的作用，开展了以下研究。由于据报道Notch1和HOXB4等分子可促进造血干细胞的自我更新，因此我们首先将Notch1与4-羟基他莫昔芬（4-HT）和4-羟基他莫昔芬（4-HT）一起注射到小鼠Lin^-Sca-1^+细胞中。使用逆转录病毒引入其活性被诱导的HOXB4并进行各种分析。在没有 4-HT 的情况下，即使存在 SCF、FLT3L 和 IL-6 等细胞因子，引入 Notch1/ERT 的细胞也不能增殖超过 14 天，而在4-HT的存在继续存在。类似地，即使存在各种细胞因子，引入模拟载体的细胞也不能增殖超过14天，而引入HOXB4的细胞在类似条件下增殖超过14天。使用半定量 RT-PCR 分析培养第 7 天的细胞周期控制分子的表达表明，诱导 Notch1 和 HOXB4 表达的细胞中 c-myc、cyclin D2、D3、E 和 E2F1 的表达增加被认可了。由于据报道单独的 c-Myc 可以诱导其他细胞类型的细胞增殖，因此将通过 4-HT 诱导 c-Myc 活性的 Myc/ERT 用于小鼠 Lin^-Sca-1 细胞并在培养皿中培养。存在细胞因子，例如 SCF、FLT3L 和 IL-6。仅当添加 4-HT 时，引入 Myc/ERT 的细胞才保持未分化的表面特征并增殖超过 28 天。此外，还观察到集落形成能力和端粒酶活性的增加。接下来，我们进行了移植实验来评估Myc/ERT转染细胞的体内功能。结果，使用 Myc/ERT 的细胞扩增支持三种血细胞谱系：骨髓单核细胞、B 细胞和 T 细胞谱系的造血作用，持续时间超过 6 个月。此外，还发现Notch1和HOXB4激活c-myc启动子，并且Notch信号在c-myc启动子内的-195至-161区域形成DNA结合蛋白。由以上结果推测，细胞周期调控分子c-Myc促进Notch和HOXB4下游造血干细胞的自我更新。

项目成果

NF-kappaB family proteins participate in multiple steps of hematopoiesis through elimination of reactive oxygen species.

• 发表时间: 2004
• 期刊: The Journal of biological chemistry
• 作者: Soichi Nakata;I. Matsumura;Hirokazu Tanaka;S. Ezoe;Yusuke Satoh;J. Ishikawa;T. Era;Y. Kanakura