細胞周期制御分子を用いた造血幹細胞の体外増幅の試み

尝试利用细胞周期控制分子体外扩增造血干细胞

• 批准号: 03J61556
• 负责人: 佐藤 友亮
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J61556/
• 关键词: 造血幹細胞; 自己複製; 細胞周期; c-Myc; 細胞周期制御分子

本研究では、造血幹細胞の自己複製における細胞周期制御分子の役割に注目し、以下の研究を行った。これまで、Notch1,HOXB4といった分子が造血幹細胞の自己複製を促すことが報告されていることから、まずはじめに、マウスLin^-Sca-1^+細胞に、4-hydroxytamoxifen(4-HT)によってNotch1活性が誘導されるNotch1/ERTとHOXB4をレトロウイルスを用いて導入し、各種の解析を行った。Notch1/ERT導入細胞は、4-HT非存在下では、SCF、FLT3L、IL-6などのサイトカイン存在下でも14日以上増殖できなかったのに対し、4-HT存在下では14日以上増殖を続けた。同様に、Mockベクター導入細胞は各種のサイトカイン存在下でも14日以上増殖できなかったのに対し、HOXB4導入細胞は同様の条件下で14日以上増殖した。培養7日目の細胞周期制御分子の発現を半定量的RT-PCR法によって解析したところ、Notch1およびHOXB4の発現を誘導した細胞では、c-myc, cyclin D2,D3,EおよびE2F1の発現上昇が認められた。他の細胞種において、c-Mycは単独で細胞増殖を誘導することが報告されていることから、4-HTによりc-Mycの活性が誘導されるMyc/ERTをマウスLin^-Sca-1^+細胞に導入し、SCF、FLT3L、IL-6などのサイトカイン存在下で培養した。Myc/ERT導入細胞は4-HT添加時のみ未分化な表面形質を保持した状態で28日以上増殖した。また、コロニー形成能とテロメレース活性の上昇が認められた。次に、Myc/ERT導入細胞の生体内での機能を評価する目的で、移植実験を行った。その結果、Myc/ERTで増幅した細胞は6ヶ月以上にわたり、骨髄単球系、B細胞系、T細胞系の3血球系統の造血を支持した。更にNotch1,HOXB4がc-mycプロモーターを活性化すること、およびNotchシグナルによってc-mycプロモーター内の-195から-161の領域にDNA結合蛋白が形成されることが、明らかとなった。以上の結果より、細胞周期制御分子c-MycはNotch, HOXB4の下流で造血幹細胞の自己複製を促すと推測された。

在这项研究中，我们专注于细胞周期调节分子在造血干细胞的自我更新中的作用，并进行了以下研究。据报道，诸如Notch1和HoxB4之类的分子促进了造血干细胞的自我更新，因此首先将Notch1活性诱导的4-羟基tamoxifen（4-HT）诱导Notch1/ERT和HOXB4，并使用Refoviruse conted retoviruass诱导了4-羟基tamoxifen（4-HT），并将其引入。在不存在4-HT的情况下，Notch1/ERT转导的细胞不能超过14天，例如SCF，FLT3L和IL-6，而在4-HT存在下它们继续生长超过14天。同样，在存在各种细胞因子的情况下，模拟量载体转导的细胞不能超过14天，而HOXB4-vector-vector-tross抑制的细胞在相似条件下生长了14天以上。通过半定量RT-PCR方法分析了第7天细胞周期调节分子的表达，并在诱导Notch1和Hoxb4的表达的细胞中观察到C-Myc，Cyclin D2，D3，E和E2F1的表达。在其他细胞类型中，据报道C-MYC单独诱导细胞增殖，因此将C-MYC的活性由4-HT诱导的MYC/ERT引入小鼠LIN^-SCA-1^+细胞中，并在诸如SCF，FLT3L和IL-6等细胞因子的存在下培养。 MYC/ERT转导的细胞生长超过28天，仅在添加4-HT时保留未分化的表面特征。另外，观察到菌落形成能力和端粒酶活性的提高。接下来，进行了移植实验，以评估体内MYC/ERT转导细胞的功能。结果，在脊髓细胞，B细胞和T细胞系的三个血细胞系中，用MYC/ERT支持造血的细胞在6个月以上。此外，揭示了Notch1和HoxB4激活C -MYC启动子，并且DNA结合蛋白在C -MYC启动子内通过Notch信号形成-195至-161。基于上述结果，据推测，细胞周期调节分子C-MYC促进了Notch下游的HOXB4的造血干细胞的自我更新。

项目成果

NF-kappaB family proteins participate in multiple steps of hematopoiesis through elimination of reactive oxygen species.

• 发表时间: 2004
• 期刊: The Journal of biological chemistry
• 作者: Soichi Nakata;I. Matsumura;Hirokazu Tanaka;S. Ezoe;Yusuke Satoh;J. Ishikawa;T. Era;Y. Kanakura