RNAポリメラーゼIIによる転写伸長反応を制御する因子群の機能解析

RNA聚合酶II转录延伸反应控制因素的功能分析

• 批准号: 03J50311
• 负责人: 遠藤 正紀
• 金额: $ 1.66万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J50311/
• 关键词: 転写伸長因子; 転写伸長反応; 試験管内転写再構成系; ヒトSpt6; 一時停止; 分子スイッチ; 精子形成; 転写伸長複合体; 核抽出液; 部分再構成; ゲルシフト法; バキュロウイルス発現系; 遺伝子発現; 転写伸長制御; 伸長複合体; カラムクロマトグラフィー

当研究室では新規転写伸長因子DSIFとNELFを精製・同定し、両因子が協調的に転写伸長反応の一時停止を誘導することを報告した。さらに、伸長因子P-TEFbによるRNAPIIのリン酸化を分子スイッチとして伸長反応が再開するモデルを提唱した。しかし伸長反応の再開、即ち一時停止を境にした初期から後期への移行に関わる因子や、その分子メカニズムに関しては未だに不明な点が多い。そこで本研究では、伸長反応の一時停止と再開に関わる因子群の同定と解析を通して、新たな転写伸長制御機構の解明を目的とした。本研究では新規因子の評価系として、精製RNAポリメラーゼII(RNAPII)と鋳型DNAのみから構成される試験管内再構成転写系を新規に構築した。一時停止の誘導にDSIFとNELFだけで必要十分であることは本評価系でも再現した。また、その再開にP-TEFbだけでは不十分であることも再現した。本研究では再開に関わる新規因子として、当研究室を含めた様々なグループの報告やデータベースの情報からヒトSpt6(hSpt6)に注目した。hSpt6を本評価系で解析したところ、hSpt6は一時停止の誘導には関与しないが、P-TEFbのリン酸化活性依存的に再開を誘導することを明らかにした。また、変異型hSpt6を用いた解析から、P-TEFbによってリン酸化されるC末端領域が機能に重要であることを明らかにした。我々は昨年度、hSpt6がDSIFと協調的に後期の伸長反応を促進することを報告している。本研究ではこの報告を併せて、P-TEFbによるリン酸化を分子スイッチとしてDSIFの協調因子がNELFからhSpt6に切り替わり、伸長反応が初期から後期へ移行するモデルを提唱した。なお、第28回日本分子生物学会年会において上記の成果をポスター発表した。また、P-TEFbによる伸長制御と精子形成に関する共同研究が論文発表された。

我们的实验室纯化并确定了新型的转录伸长因子DSIF和NELF，并报告说，这两个因素都协同引起了转录伸长反应的暂停。此外，我们提出了一个模型，在该模型中，扩展反应通过RNAPII通过扩展因子P-TEFB作为分子开关恢复。然而，关于延长反应的恢复涉及的因素，仍然有许多未知数，即从早期到晚期到晚期的过渡，暂停伸长反应及其分子机制。因此，这项研究旨在通过鉴定和分析暂停和恢复伸长响应的因素来阐明转录伸长控制的新机制。在这项研究中，我们新构建了仅由纯化的RNA聚合酶II（RNAPII）和模板DNA组成的体外重建转录系统，以评估新因素。该评估系统还重现了DSIF和NELF足以引起暂停的事实。它还重现了单独的P-TEFB不足以恢复它。这项研究的重点是人类SPPT6（HSPT6）作为重新开放的新因素，基于包括我们的实验室在内的各个小组的报告以及来自数据库的信息。当使用此评估系统分析HSPT6时，发现HSPT6不参与暂停的诱导，而是在P-TEFB的磷酸化活性中以依赖方式诱导恢复。此外，使用突变体HSPT6的分析表明，P-TEFB磷酸化的C末端区域对于功能很重要。去年我们报道说，HSPT6与DSIF共同促进了较晚的伸长响应。在这项研究中，我们提出了一个模型，其中使用P-TEFB磷酸化作为分子开关将DSIF的合作因子从NELF转换为HSPT6，而伸长反应反应从早期阶段转变为晚期。上述结果是在日本分子生物学学会的第28届年会上作为海报提出的。此外，已经发表了对P-TEFB对伸长和精子发生调节的联合研究。

项目成果

Infertility with Defective Spermiogenesis in Mice Lacking AF5q31, the Target of Chromosomal Translocation in Human Infant Leukemia

• DOI: 10.1128/mcb.25.15.6834-6845.2005
• 发表时间: 2005-08
• 期刊: Molecular and Cellular Biology
• 影响因子: 5.3
• 作者: Atsushi Urano;M. Endoh;T. Wada;Y. Morikawa;M. Itoh;Y. Kataoka;T. Taki;H. Akazawa;H. Nakajima;I. Komuro;N. Yoshida;Y. Hayashi;H. Handa;T. Kitamura;T. Nosaka