細胞質雄性不稔イネに対する稔性回復遺伝子のクローニングと分子機構の解明

水稻细胞质雄性不育育性恢复基因的克隆及其分子机制的阐明

• 批准号: 03J07407
• 负责人: 風間 智彦
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J07407/
• 关键词: 細胞質雄性不稔; ミトコンドリア; 転写後制御; 分子生物学; イネ

本年度は、Boro型細胞質雄性不稔イネの稔性を回復させる稔性回復遺伝子Rf1のコードするPPRタンパク質が、ミトコンドリア内において、分子レベルでどのような機能をしているのか、について焦点をあてて解析を行った。PPR(pentatricopeptide repeat)タンパク質は、比較的相同性の高い35アミノ酸の繰り返し配列を持つタンパク質である。このタンパク質は、高等植物で特異的に大きなファミリーを形成していることが報告されている。また、葉緑体やミトコンドリアにおいて、RNAの成熟反応(切断、スプライシング、RNAエディティングなど)に関与していると考えられている。これまでの成果により、Rf1タンパク質はBoro型細胞質のミトコンドリアにおいて、雄性不稔性関連遺伝子であるatp6-orf79RNAの切断に関与していることが明らかとなっている。まず、プライマー伸長法を行い、プロセッシングされたorf79 RNAの5'末端を決定することで、プロセッシングサイトの決定を行った。この結果、orf79の開始コドンより52nt〜55nt上流にプロセッシングサイトを決定することが出来た。この領域を含む400nt RNAの2次構造を予測したところ、プロセッシングサイトは2本のステムループに囲まれた1本鎖RNA領域に散在することが明らかとなった。このことは、RNAの成熟反応の解析が先行している葉緑体の結果とも矛盾しない。さらに、Rf1タンパク質が、このプロセッシングサイトを含むRNAと結合するかどうかを、リコンビナントRf1とのゲルシフトアッセイで調査した。この結果、リコンビナントRf1タンパク質と400nt RNAの結合が確認された。一方で、Rf1アミノ酸配列からは、RNA結合能を持つPPRモチーフ以外に、RNAの切断に有効なモチーフなどは見つかっていない。これらのことより、Rf1タンパク質はatp6-orf79 RNAの遺伝子間領域に結合することで、RNaseの機能を助けていることが考えられた。また、プロセッシングサイトの配列がアデニンリッチな配列であることや、ステムループに囲まれた1本鎖に位置することより、RNAの切断自体にはRNaseE様のRNaseの関与が示唆された。

今年，我们专注于对由RF1编码的PPR蛋白的分析，RF1是一种生育能力恢复基因，可恢复硼型细胞质雄性无菌水稻的生育能力，该大米在线粒体的分子水平上起作用。 PPR（五肽重复）蛋白是具有相对同源的35种氨基酸的重复序列的蛋白质。据报道，该蛋白质在高等植物中形成了一个大型家庭。还认为它参与了叶绿体和线粒体中的RNA成熟反应（例如裂解，剪接，RNA编辑）。先前的结果表明，RF1蛋白参与了硼型细胞质的线粒体中ATP6-ORF79RNA（雄性无菌相关基因）的裂解。首先，使用引物扩展方法来确定处理后的ORF79 RNA的5'端。结果，确定了ORF79起始密码子上游52 nt至55 nt的处理位点。预测包含该区域的400 NT RNA的二级结构表明，加工位点散布在一个被两个茎环包围的单链RNA区域中。这与叶绿体的结果一致，叶绿体的结果先前已经分析了RNA的成熟。此外，在用重组RF1的凝胶移位测定中研究了RF1蛋白是否与含有该加工位点的RNA结合。结果，确认了重组RF1蛋白与400 nt RNA的结合。另一方面，除具有RNA结合能力的PPR基序以外，在RF1氨基酸序列中没有有效裂解RNA的基序。从这些发现中，人们认为RF1蛋白与ATP6-ORF79 RNA的基因间区域结合，有助于RNase的功能。此外，加工位点序列是富含腺嘌呤的序列，它位于被茎环包围的单链上，这表明RNASEE样RNass与RNA裂解本身有关。