細胞質雄性不稔イネに対する稔性回復遺伝子のクローニングと分子機構の解明

水稻细胞质雄性不育育性恢复基因的克隆及其分子机制的阐明

• 批准号: 03J07407
• 负责人: 風間 智彦
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J07407/
• 关键词: 細胞質雄性不稔; ミトコンドリア; 転写後制御; 分子生物学; イネ

本年度は、Boro型細胞質雄性不稔イネの稔性を回復させる稔性回復遺伝子Rf1のコードするPPRタンパク質が、ミトコンドリア内において、分子レベルでどのような機能をしているのか、について焦点をあてて解析を行った。PPR(pentatricopeptide repeat)タンパク質は、比較的相同性の高い35アミノ酸の繰り返し配列を持つタンパク質である。このタンパク質は、高等植物で特異的に大きなファミリーを形成していることが報告されている。また、葉緑体やミトコンドリアにおいて、RNAの成熟反応(切断、スプライシング、RNAエディティングなど)に関与していると考えられている。これまでの成果により、Rf1タンパク質はBoro型細胞質のミトコンドリアにおいて、雄性不稔性関連遺伝子であるatp6-orf79RNAの切断に関与していることが明らかとなっている。まず、プライマー伸長法を行い、プロセッシングされたorf79 RNAの5'末端を決定することで、プロセッシングサイトの決定を行った。この結果、orf79の開始コドンより52nt〜55nt上流にプロセッシングサイトを決定することが出来た。この領域を含む400nt RNAの2次構造を予測したところ、プロセッシングサイトは2本のステムループに囲まれた1本鎖RNA領域に散在することが明らかとなった。このことは、RNAの成熟反応の解析が先行している葉緑体の結果とも矛盾しない。さらに、Rf1タンパク質が、このプロセッシングサイトを含むRNAと結合するかどうかを、リコンビナントRf1とのゲルシフトアッセイで調査した。この結果、リコンビナントRf1タンパク質と400nt RNAの結合が確認された。一方で、Rf1アミノ酸配列からは、RNA結合能を持つPPRモチーフ以外に、RNAの切断に有効なモチーフなどは見つかっていない。これらのことより、Rf1タンパク質はatp6-orf79 RNAの遺伝子間領域に結合することで、RNaseの機能を助けていることが考えられた。また、プロセッシングサイトの配列がアデニンリッチな配列であることや、ステムループに囲まれた1本鎖に位置することより、RNAの切断自体にはRNaseE様のRNaseの関与が示唆された。

今年，我们将重点对恢复Boro型细胞质雄性不育水稻育性的育性恢复基因Rf1编码的PPR蛋白如何在线粒体内的分子水平上发挥作用进行分析。 PPR（五肽重复）蛋白是一种具有35个氨基酸重复序列、同源性较高的蛋白质。据报道，这种蛋白质形成一个大家族，特别是在高等植物中。它还被认为参与叶绿体和线粒体中的 RNA 成熟反应（切割、剪接、RNA 编辑等）。先前的结果表明，Rf1蛋白参与Boro型细胞质线粒体中与雄性不育相关的基因atp6-orf79 RNA的切割。首先，通过进行引物延伸法并确定加工后的orf79 RNA的5'末端来确定加工位点。结果，我们能够确定 orf79 起始密码子上游 52 至 55 nt 处的加工位点。对包含该区域的 400 nt RNA 二级结构的预测表明，加工位点分散在被两个茎环包围的单链 RNA 区域中。这与叶绿体的结果一致，首先分析了叶绿体的 RNA 成熟反应。此外，我们使用重组 Rf1 进行凝胶位移测定，研究了 Rf1 蛋白是否与含有该加工位点的 RNA 结合。结果，证实了重组Rf1蛋白与400nt RNA之间的结合。另一方面，在Rf1氨基酸序列中，除了具有RNA结合能力的PPR基序之外，没有发现其他对RNA切割有效的基序。这些结果表明，Rf1 蛋白通过与 atp6-orf79 RNA 的基因间区域结合来帮助 RNase 发挥功能。此外，由于加工位点是富含腺嘌呤的序列并且位于被茎环包围的单链上，因此表明像RNaseE这样的RNase参与RNA切割本身。