色素体核様体の構造を介した機能統御の研究

通过质体核仁结构进行功能控制的研究

基本信息

批准号：
03J05869
负责人：
関根康介
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Saitama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

色素体DNAは多くのタンパク質と核様体と呼ばれる複合体を形成するが,その主要タンパク質の一つとして亜硫酸還元酵素(SiR)が同定されている。しかしこれまでSiRは葉緑体の可溶性画分に酵素活性があることからストロマに局在すると考えられてきた。本研究の目的はSiRのDNA結合能と酵素としての機能の関係を解明することである。昨年度までに,エンドウSiRcDNAの塩基配列を決定し,それをもとに作成した組換えタンパク質にDNA結合能があることを確認した。平成16年度は,SiRのDNA結合能を詳細に解析するために、決定したエンドウSiRのcDNA塩基配列をもとに大量の組換えタンパク質の作成を試みた。SiRはフェレドキシンと親和性があるため,フェレドキシン-アフィニティクロマトグラフィにより精製を行った。すでにトウモロコシ等のSiRについては確立された精製法であるが,エンドウSiRでは精製過程での挙動が異なり,収率も非常に低かった。わずかに得られた組換えエンドウSiRについて吸光分光分析を行ったところ,SiRが持つ補欠分子族固有のスペクトルが得られた。また,ストロマと核様体のそれぞれに局在するSiRについて分子構造の観点から比較した。質量分析法を行ったところ,両者で分子量が異なるという結果が得られたが,葉緑体全体について分析を行ったところ,異なる分子量のSiRは検出されなかった。したがって両者の分子量の違いは試料調整の操作中に生じた可能性があり,今後更なる検討が必要である。

质体 DNA 与许多蛋白质形成称为类核的复合物，亚硫酸还原酶 (SiR) 已被确定为主要蛋白质之一。然而，到目前为止，SiR 被认为位于基质中，因为酶活性存在于叶绿体的可溶部分中。本研究的目的是阐明 SiR 的 DNA 结合能力与其作为酶的功能之间的关系。去年，我们确定了豌豆SiR cDNA的碱基序列，并证实基于其构建的重组蛋白具有DNA结合能力。 2004年，为了详细分析SiR的DNA结合能力，我们尝试根据已确定的豌豆SiR的cDNA碱基序列来大量制造重组蛋白。由于 SiR 对铁氧还蛋白具有亲和力，因此通过铁氧还蛋白亲和层析对其进行纯化。虽然这种纯化方法已经建立在玉米和其他作物的SiR上，但豌豆SiR在纯化过程中的行为不同，且收率很低。对得到的少量重组豌豆SiR进行吸光度光谱分析，得到了SiR所具有的辅基所特有的光谱。我们还从分子结构的角度比较了位于基质和类核中的SiR。质谱分析显示两者的分子量不同，但对整个叶绿体进行分析时，没有检测到不同分子量的SiR。因此，两者之间的分子量差异可能是在样品制备过程中出现的，需要进一步研究。