モノクロ-ナル抗体を用いたS.schenckiiの二形性変換機構の解析

单克隆抗体分析申克沙门氏菌二态性转化机制

• 批准号: 03670530
• 负责人: 原田 敬之
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Keio University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1991
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1991 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03670530/
• 关键词: Sporothrix schenckii; モノクロ-ナル抗体; 二形性; 遺伝子; cDNAクロ-ン

慢性難治性深在性真菌症の代表的疾患のスポロトリコ-シスの原因菌であるSporothrix(S.)schenckiiの二形性変換機構を解明するために、先ずS.schenckiiの菌糸形、酵母形および両者の変換過程にある菌体における合成タンパクについて解析した。即ち、皮膚スポロトリコ-シス患者より分離・同定されたS.schenckiiを菌糸形、酵母形、各形細胞に ^<35>Sーメチオニンを取り込ませ、合成されたタンパクを10%SDS、2M ureaで可溶化し、SDSスクラブゲル電気泳動にて解析した。その結果、菌糸形細胞に時異的なタンパクは分子量約45kdであること、また、そのタンパクは菌糸形細胞に特異的に発現するRNAより無細胞蛋白合成系を用いて翻訳されたタンパクとほぼ一致することを見出だした。得られたタンパクを単離し、マウスに免疫し、ELISA法にて抗体価の十分な上昇を確認した上で、murine myeloma cell line sp 2/0とfusionさせ、特異抗体産生細胞を得て、現在その特異性について、ELISA法、PAGE法で検討中である。一方、菌糸形、酵母形、各形細胞を4M guanidine thiocyanate溶液中で粉砕し、フェノ-ル抽出、エタノ-ル沈澱で核酸を抽出し、オリゴdTセルロ-スカラムにてMRNAを分離した。45kdタンパクを認識する特異的モノクロ-ナル抗体が得られたら、λgT11を用いてcDNA expression libraryを作成し、本モノクロ-ナル抗体によるスクリ-ニングを行い、菌糸形特異的cDNAクロ-ンを単離する予定である。

为了阐明申克孢子丝菌（Sporothrix (S.) schenckii）的二态性转化机制，孢子丝菌病是一种慢性难治性深部真菌病的典型疾病，我们首先研究了其菌丝形式、酵母形式，并分析了其合成蛋白。细菌细胞正在进行两者之间的转换过程。即，将从皮肤孢子丝菌病患者中分离和鉴定的申克沙门氏菌引入菌丝、酵母和其他形式的细胞中以掺入^ 35 S-甲硫氨酸，并将合成的蛋白质与10％的培养基一起温育。 SDS和2M尿素溶解并通过SDS洗涤凝胶电泳进行分析。结果发现，在菌丝细胞中暂时表达的蛋白质的分子量约为45 kd，与特异表达的RNA相比，该蛋白质与使用无细胞蛋白质合成系统翻译的蛋白质相似。我发现在菌丝细胞中表达。分离获得的蛋白质，免疫小鼠，使用ELISA确认抗体滴度充分增加后，与鼠骨髓瘤细胞系sp 2/0进行融合，以获得特异性抗体产生细胞，目前正在使用ELISA研究其特异性。和 PAGE 方法。另一方面，将菌丝体、酵母和其他类型的细胞在4M硫氰酸胍溶液中粉碎，通过苯酚提取和乙醇沉淀提取核酸，并使用寡聚dT纤维素柱分离mRNA。一旦获得了识别 45kd 蛋白的特异性单克隆抗体，我们计划使用 λgT11 创建 cDNA 表达文库，用该单克隆抗体进行筛选，并分离菌丝类型特异性 cDNA 克隆。

项目成果

A.J.Hamilton: "Preparation of murine monoclonal antibodies against the yeast phase of the dimorphic fungus Sporothrix schenckil" Transactions of the Royal Society of Tropical and Medicine. 84. 734-737 (1990)

A.J.Hamilton：“针对二态性真菌申克孢子丝菌酵母阶段的鼠单克隆抗体的制备”英国皇家热带与医学学会汇刊。

繁益 弘志: "Sporothrix schenckiiの二形性変換における遺伝子発現について" 日本医真菌学会雑誌. 31(増). 81 (1990)

Hiroshi Shigemasu：“申克孢子丝菌二态性转化过程中的基因表达”，日本医学真菌学会杂志 31（1990 年）。