アブラナ科植物の自家不和合性における自他識別機構の解明

十字花科植物自交不亲和中的自-他歧视机制的阐明

• 批准号: 03J01689
• 负责人: 下里 裕子
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J01689/
• 关键词: 自家不和合性; 受容体型キナーゼ; アブラナ科植物; リン酸化; アブラナ科

これまでに、アブラナ科植物の自家不和合性反応が、花粉表層に存在するSP11(塩基性低分子量蛋白質)と柱頭細胞膜上に存在する自己のSRK(受容体型キナーゼ)との特異的な結合によって引き起こされることを明らかにしてきた。また、SP11結合に伴いSRKの自己リン酸化レベルが上昇することを見いだしている。従って、SRKも動物のreceptorキナーゼ同様、リガンド結合による自己リン酸化レベルの上昇によりキナーゼ活性が活性化し、更に下流へシグナルを伝達するものと考えられる。そこで本年度は、SRKの活性化機構を明らかにするため、SRKの自己リン酸化部位の同定を行った。柱頭上のSRKの存在量は大変少ないため、自己リン酸化部位の同定は大変困難であることが予想された。そこでまず、大腸菌によるSRKキナーゼドメインの組み換え蛋白質を作製し、この組み換え蛋白質における自己リン酸化部位について解析を行った。組換え蛋白質は、SDS-PAGEにより泳動分離した後に、トリプシンによるゲル内消化に供した。この消化物を質量分析器LC-MS/MS (nanoLC-ESI-Q-TOF MS)により分析することで、リン酸化部位の同定を行った。リン酸化ペプチドの同定は、非リン酸化ペプチドに対するリン酸化ペプチドの割合が低くかった為、IMACを用いたリン酸化ペプチド濃縮法などの前処理を組み合わせて行った。その結果、SRK8及びSRK9のキナーゼドメインについて合計13箇所のリン酸化部位を同定することができた。そこで、幾つかのリン酸化部位について、抗リン酸化ペプチド抗体を作製したところ、リン酸化特異的に反応する抗体を得ることができた。現在、これらの抗体を用いて柱頭細胞膜上のSRKの自己リン酸化レベルについて解析を行っている。

迄今为止，在花粉表层中存在的SP11（基本低分子量蛋白）与存在于花粉表层中的自我-SRK（受体激酶）之间的特定键（受体激酶）。还发现SRK的自氧化物水平随SP11键增加。因此，像动物的受体激酶一样，SRK被认为是激活的激酶活性，这是由于配体粘结引起的自磷酸化水平的上升，然后将信号传输到下游。因此，在这个财政年度，确定了SRK的自氧化位点以阐明SRK激活机制。由于顶部的SRK存在非常低，因此预计自氧化位点的识别非常困难。因此，首先，准备了大肠杆菌的SRK Kinazedmain的重组蛋白，并在该重组蛋白的自氧化部位进行了分析。通过SDS-PAGE分离改性的蛋白质，然后通过胰蛋白酶在凝胶中消化。通过用质谱仪LC-MS/MS（Nanolc-si-Q-TOF MS）分析该数字仪来鉴定磷酸化位点。通过使用imac的磷酸化肽富集方法（例如，非磷酸化肽的磷酸化比率）的比率较低，肽磷酸化的磷酸化鉴定是通过磷酸化肽富集方法的组合结合的。结果，总共确定了SRK8和SRK9的亲信体的13个磷酸化位点。因此，当对某些磷酸化部分产生了几种磷酸化的肽抗体时，获得了在磷酸化中特别反应的抗体。当前，这些抗体正在分析平行细胞膜上SRK的自磷酸化水平。