アブラナ科植物の自家不和合性における自他識別機構の解明

十字花科植物自交不亲和中的自-他歧视机制的阐明

• 批准号: 03J01689
• 负责人: 下里 裕子
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Nara Institute of Science and Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J01689/
• 关键词: 自家不和合性; 受容体型キナーゼ; アブラナ科植物; リン酸化; アブラナ科

これまでに、アブラナ科植物の自家不和合性反応が、花粉表層に存在するSP11(塩基性低分子量蛋白質)と柱頭細胞膜上に存在する自己のSRK(受容体型キナーゼ)との特異的な結合によって引き起こされることを明らかにしてきた。また、SP11結合に伴いSRKの自己リン酸化レベルが上昇することを見いだしている。従って、SRKも動物のreceptorキナーゼ同様、リガンド結合による自己リン酸化レベルの上昇によりキナーゼ活性が活性化し、更に下流へシグナルを伝達するものと考えられる。そこで本年度は、SRKの活性化機構を明らかにするため、SRKの自己リン酸化部位の同定を行った。柱頭上のSRKの存在量は大変少ないため、自己リン酸化部位の同定は大変困難であることが予想された。そこでまず、大腸菌によるSRKキナーゼドメインの組み換え蛋白質を作製し、この組み換え蛋白質における自己リン酸化部位について解析を行った。組換え蛋白質は、SDS-PAGEにより泳動分離した後に、トリプシンによるゲル内消化に供した。この消化物を質量分析器LC-MS/MS (nanoLC-ESI-Q-TOF MS)により分析することで、リン酸化部位の同定を行った。リン酸化ペプチドの同定は、非リン酸化ペプチドに対するリン酸化ペプチドの割合が低くかった為、IMACを用いたリン酸化ペプチド濃縮法などの前処理を組み合わせて行った。その結果、SRK8及びSRK9のキナーゼドメインについて合計13箇所のリン酸化部位を同定することができた。そこで、幾つかのリン酸化部位について、抗リン酸化ペプチド抗体を作製したところ、リン酸化特異的に反応する抗体を得ることができた。現在、これらの抗体を用いて柱頭細胞膜上のSRKの自己リン酸化レベルについて解析を行っている。

迄今为止，已经表明，十字花科植物中的自体不兼容反应是由花粉表面层中存在的SP11（基本低分子量蛋白）的特异性结合引起的，并且存在于柱头细胞膜上的自体SRK（受体类型激酶）。此外，已经发现SRK的自磷酸化水平随SP11结合而增加。因此，像动物受体激酶一样，SRK被认为由于配体结合而引起的自磷酸化水平增加而激活激酶活性，并进一步向下游传输信号。因此，今年为了阐明SRK激活的机制，我们确定了SRK的自磷酸化位点。由于SRK在污名上的丰度很小，因此预计自磷酸化位点的鉴定将非常困难。首先，通过大肠杆菌制备了SRK激酶结构域的重组蛋白，并分析了该重组蛋白的自磷酸化位点。通过SDS-PAGE迁移后，将重组蛋白用胰蛋白酶进行内部消化。通过质谱仪LC-MS/MS（nanolc-si-Q-TOF MS）分析消化物，以鉴定磷酸化位点。通过使用iMAC结合预处理（例如磷酸肽富集方法）进行磷酸肽鉴定，因为磷酸肽与非磷酸肽的比例很低。结果，为SRK8和SRK9的激酶结构域确定了总共13个磷酸化位点。因此，制备了几种磷酸化位点的抗磷酸肽抗体，并获得了在磷酸化中特别反应的抗体。目前，这些抗体用于分析柱头细胞膜上SRK的自磷酸化水平。