高等植物の葉緑体におけるRNAエディティングの分子機構の解明

高等植物叶绿体RNA编辑分子机制的阐明

• 批准号: 03J00844
• 负责人: 宮本 徹也
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J00844/
• 关键词: 葉緑体; RNAエディティング; psbE; in vitro; タバコ; シロイヌナズナ

RNAエディティングとは、ゲノムDNAの塩基配列が転写された後RNA上で変わる現象のことで、高等植物の葉緑体ではシチジン残基(C)からウリジン残基(U)への変換が知られている。タバコの葉緑体ゲノムには約110種の遺伝子が存在し、現在までに34カ所のエディティング部位がタンパク質をコードしている領域で見い出されている。しかし、それぞれのエディティング部位周辺に共通の配列や構造が見られないことから、34カ所ものCがどのようにして認識されているのかが大きな謎となっている。そこで本研究ではタバコ葉緑体抽出液を用いたin vitro RNAエディティング系により、葉緑体遺伝子psbEとpetBをモデルとし、エディティング部位認識機構の解析を行っている。本年度は、前年度までに明らかにしたpsbE mRNAのエディティング反応に関わっている56kDaのタンパク質(p56)の同定を試みた。このタンパク質はエディティング部位上流のシス配列だけではなく、エディティング部位とも直接結合していることを既に明らかにしており、エディティング反応そのものを行っている可能性のある、非常に特異なものである。方法としては、まずタバコ葉緑体抽出液を作製し、それを硫安分画、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、RNAアフィニティークロマトグラフィーによりp56を精製した。精製タンパク質をMS/MSにより解析した結果、数本のアミノ酸配列が得られた。その配列を基にシロイヌナズナからp56の相同遺伝子の同定を試みたが、候補を絞りきれず、うまくいかなかった。原因としては、得られた配列が短すぎたこと、タバコとシロイヌナズナで予想以上に目的の遺伝子の配列が異なっていることが考えられる。遺伝子の同定には失敗したが、精製過程で数多くのp56に関する生化学的知見が得られたので、今後の研究に役立てるものと期待している。

RNA编辑是转录后RNA上的基因组DNA的碱基序列发生变化的现象，已知在高等植物的叶绿体中胞苷残基(C)向尿苷残基(U)的转变。烟草叶绿体基因组中约有110个基因，迄今为止在蛋白质编码区已发现34个编辑位点。然而，由于在每个编辑位点周围没有发现共同的序列或结构，因此如何识别 34 个 C 仍然是一个很大的谜团。因此，在本研究中，我们使用烟草叶绿体提取物的体外RNA编辑系统，以叶绿体基因psbE和petB为模型，分析了编辑位点识别机制。今年，我们试图鉴定前一年发现的、参与 psbE mRNA 编辑反应的 56kDa 蛋白 (p56)。已经表明，该蛋白质不仅与编辑位点上游的顺式序列结合，而且还直接与编辑位点结合，并且是一种非常独特的蛋白质，其本身可能执行编辑反应。首先，制备烟草叶绿体提取物，并使用硫酸铵分级分离、肝素亲和色谱和RNA亲和色谱纯化p56。对纯化的蛋白质进行 MS/MS 分析，获得了几个氨基酸序列。试图根据该序列从拟南芥中鉴定p56的同源基因，但由于无法缩小候选范围而没有成功。可能的原因包括获得的序列太短以及烟草和拟南芥之间靶基因序列的差异超出预期。尽管我们无法识别该基因，但我们在纯化过程中获得了有关 p56 的许多生化结果，我们希望这些结果对未来的研究有用。

项目成果

宮本, 小保方, 杉浦: "A site-specific factor interacts directly with its cognate RNA editing site in chloroplast transcripts"Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101. 48-52 (2004)

Miyamoto、Obokata、Sugiura：“位点特异性因子直接与其叶绿体转录本中的同源 RNA 编辑位点相互作用”，《美国国家科学院院刊》101. 48-52 (2004)。