高等植物の葉緑体におけるRNAエディティングの分子機構の解明

高等植物叶绿体RNA编辑分子机制的阐明

• 批准号: 03J00844
• 负责人: 宮本 徹也
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J00844/
• 关键词: 葉緑体; RNAエディティング; psbE; in vitro; タバコ; シロイヌナズナ

RNAエディティングとは、ゲノムDNAの塩基配列が転写された後RNA上で変わる現象のことで、高等植物の葉緑体ではシチジン残基(C)からウリジン残基(U)への変換が知られている。タバコの葉緑体ゲノムには約110種の遺伝子が存在し、現在までに34カ所のエディティング部位がタンパク質をコードしている領域で見い出されている。しかし、それぞれのエディティング部位周辺に共通の配列や構造が見られないことから、34カ所ものCがどのようにして認識されているのかが大きな謎となっている。そこで本研究ではタバコ葉緑体抽出液を用いたin vitro RNAエディティング系により、葉緑体遺伝子psbEとpetBをモデルとし、エディティング部位認識機構の解析を行っている。本年度は、前年度までに明らかにしたpsbE mRNAのエディティング反応に関わっている56kDaのタンパク質(p56)の同定を試みた。このタンパク質はエディティング部位上流のシス配列だけではなく、エディティング部位とも直接結合していることを既に明らかにしており、エディティング反応そのものを行っている可能性のある、非常に特異なものである。方法としては、まずタバコ葉緑体抽出液を作製し、それを硫安分画、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィー、RNAアフィニティークロマトグラフィーによりp56を精製した。精製タンパク質をMS/MSにより解析した結果、数本のアミノ酸配列が得られた。その配列を基にシロイヌナズナからp56の相同遺伝子の同定を試みたが、候補を絞りきれず、うまくいかなかった。原因としては、得られた配列が短すぎたこと、タバコとシロイヌナズナで予想以上に目的の遺伝子の配列が異なっていることが考えられる。遺伝子の同定には失敗したが、精製過程で数多くのp56に関する生化学的知見が得られたので、今後の研究に役立てるものと期待している。

RNA编辑是指转录后基因组DNA的核苷酸序列在RNA上的核苷酸序列，而在较高植物的叶绿体中，cytidine残基（C）转化为尿苷残基（u）。烟草叶绿体基因组中大约有110个基因，迄今为止，在蛋白质编码区域中发现了34个编辑位点。但是，由于每个编辑站点周围没有共同的布置或结构，因此如何识别34 CS是一个主要的谜。因此，在这项研究中，我们使用烟草叶绿体提取物使用烟草叶绿体提取物使用PSBE和PETB分析了使用体外RNA编辑的编辑位点识别机制。今年，我们试图确定参与PSBE mRNA的编辑反应的56KDA蛋白（p56），我们已经揭示了上一年。已经揭示了该蛋白质不仅与编辑位点上游的顺式序列直接结合，而且还与编辑位点结合，并且非常独特，这可能已经进行了编辑反应本身。作为一种方法，首先制备烟草叶绿体提取物，并通过硫酸铵分馏，肝素亲和色谱和RNA亲和色谱法纯化p56。通过MS/MS分析纯化的蛋白质，并获得了几个氨基酸序列。根据序列，我们试图从拟南芥中识别p56的同源基因，但我们无法缩小候选者的范围，结果不成功。原因可能是获得的序列太短，并且感兴趣基因的序列与烟草和拟南芥之间的预期不同。尽管基因识别未成功，但在纯化过程中获得了许多有关p56的生化发现，因此我们希望它对将来的研究有用。

项目成果

宮本, 小保方, 杉浦: "A site-specific factor interacts directly with its cognate RNA editing site in chloroplast transcripts"Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 101. 48-52 (2004)

Miyamoto、Obokata、Sugiura：“位点特异性因子直接与其叶绿体转录本中的同源 RNA 编辑位点相互作用”，《美国国家科学院院刊》101. 48-52 (2004)。