多機能アダプタータンパク質GGAの細胞内小胞輸送における役割

多功能衔接蛋白GGA在细胞内囊泡运输中的作用

基本信息

批准号：
03J00249
负责人：
芝陽子
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Kyoto University (2004)University of Tsukuba (2003)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03J00249/
关键词：
GGA ユビキチン GAT

项目摘要

本年度は昨年明らかにしたGGA-GATドメインとユビキチンとの結合様式をより詳細に調べるために、高エネルギー加速器研究機構の若槻壮市先生、名古屋市立大学の加藤晃一先生らの研究室とともにC-GATドメインとユビキチンとの三次元構造を決定した。まず若槻研究室におけるX線結晶構造解析により、C-GATドメインのN末端側とユビキチンとの複合体の構造を決定した。しかし、C-GATのN末端側とユビキチンが結合するという構造は以前私が変異体解析により同定したC-GATのC末端側がユビキチンとの結合サイトになるという結果とは異なっていた。結晶ではC-GATのC末端側に関してはC-GAT同士のダイマー形成に関与しており、ユビキチンとは結合していないが、C-GATのダイマー形成は溶液中では起こっておらず、おそらく結晶化時のアーティファクトと思われる。そこでC-GATのN末端側およびC末端側にそれぞれ変異を入れた変異体、および両方に変異を入れた変異体を作成し、pull down解析およびBIACOREを用いた定量的な結合実験を行ったところ、いずれも一カ所の変異でも結合能あるいは最大結合量が落ちるが、両方に変異を入れた変異体でさらに結合能が下がることがわかった。この結果からC-GATドメインは二カ所でユビキチンと結合していることが示唆された。GATのC末端側とユビキチンとの複合体の構造が依然はっきりしなかったため、加藤晃一先生との共同研究によりNMRによる解析を行った。NMRでも溶液中でC-GATは二ヶ所でユビキチンと結合することが確認でき、またC-GATのN末端側に変異を入れた変異体とユビキチンとの結合様式を調べることにより、C-GATのC末端側とユビキチンとの結合様式を調べることができた。この結果以前私が同定したユビキチンとの結合に重要なC-GATのC末端側の残基が重要な働きをすることが、NMR解析においてもあきらかとなった。

今年，为了研究GGA-GAT领域与泛素之间的绑定风格，这是详细揭示的，C-Gat与高能加速器研究的Tosai Wakatsuki博士和Nagoya City University的Koichi Kato。决定了域和泛素之间的尺寸结构。首先，确定Wakatsuki Lab中的X射线晶体结构分析，以确定C-GAT结构域和泛素的N端侧之间复合物的结构。但是，C-GAT和泛素结合的N端一侧与我先前通过突变分析鉴定的C-GAT C末端侧成为具有泛素的结合位点的结构不同。在晶体中，C-GAT C末端参与C-GAT之间的变暗形成，并且不键入泛素，但是溶液中没有C-Gat Dimmer的形成，并且可能是晶体在谋求时似乎是人工制品。因此，我们在C-GAT N末端和C端侧创建了一个突变体，并且在两者中都有一个突变体，并且使用Biacore和Biacore进行了定量键合实验。即使在一个突变中，结合量也下降了，但是发现将突变放置在两者中的突变体进一步降低了结合能力。结果表明，C-GAT域在两个地方与两个位置结合。由于仍然尚不清楚GAT C末端和泛素之间的复合物的结构，因此通过与Koichi Kato教授进行联合研究对NMR进行了分析。即使在NMR中，C-GAT也可以证实C-GAT在两个地方与Ubikitin结合，并通过检查突变体和泛素之间的结合形式，并在C-GAT N E-END i上进行突变能够检查C端侧和泛素之间的结合样式。结果，在NMR分析中很明显，C-GAT C-GAT上的残基对与我之前已经确定的泛素结合起来很重要，它起着重要功能。