紫外共鳴ラマン分光法によるDNA結合蛋MerRの金属錯体における金属種区別法の解明

阐明使用紫外共振拉曼光谱区分 DNA 结合蛋白 MerR 金属复合物中金属种类的方法

• 批准号: 03F03100
• 负责人: 北川 禎三
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: National Institutes of Natural Sciences Okazaki Research Facilities
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03F03100/
• 关键词: 紫外共鳴ラマン; p53; ガン抑制因子; 共鳴ラマン; 亜鉛感受性蛋白質; 紫外共鳴ラマン; p53; ガン抑制因子; 共鳴ラマン; 亜鉛感受性蛋白質

DNA結合蛋白MerRを報告されている方法にしたがって単離・精製した。生化学的な活性を測定する量はこれで取れるが、分光学的測定を行うには大量に蛋白を取る必要があり、そのためには発現系を用いてリコンビナント蛋白を作る事が必須であるが、その実験がうまくいかなかった。そこでDNA結合金属蛋白の第2候補である亜鉛感受性p53蛋白を取り上げた。P53はガン抑制因子と呼ばれ、DNAの複製や細胞の成長、細胞の分裂などに関わる蛋白質である。ガン細胞にはp53の変異体が多く蓄積する事から、この蛋白質が正常に機能している事で腫瘍やガンの成長を抑制していると考えられる。本研究ではp53の情報伝達メカニズムを紫外共鳴ラマン分光法を用いて分子レベルで明らかにする事を目的とした。P53のcDNAを入手し、DNA結合ドメインをPCRで増幅して発現ベクターに組込んで大腸菌での発現系を構築した。DNAから蛋白質への翻訳コドンは真核生物と原核生物で好みが違うため、ヒト由来p53を大腸菌で発現させると発現効率が悪かった。初めは1L当り0.2mg程度の蛋白しか得られなかった。そこで発現条件の最適化にかなりの労力を投入し、当初の50倍の収量が得られるようになった。精製物は金属を含まないアポ蛋白質であったので、Zn、Hg、Ni等で蛋白を再構成した。それをヘパリンカラムで精製し、質量スペクトルを測定した。モノマーとオリゴマーの混合物であった。SDS PAGEで分子量を決め、モノマー部分を純粋にして吸収スペクトルを測定した。235と280nmに吸収極大を示した。その244nm励起の共鳴ラマンスペクトルを測定する事に成功した。アポ蛋白質には無くてZn錯体で初めて現れるラマンバンドが911cm^<-1>にあり、これをZnに配位するヒスチヂンの振動に帰属した。またZn錯体には、184、222、260cm^<-1>にラマンバンドが見られた。ラマン励起光の波長を229や206nmにするとそれらのバンドがどう変るかを実験しつつある。

根据报道的方法将DNA结合蛋白MERR分离并纯化。这允许测量生化活性的数量，但是为了进行光谱测量，需要大量蛋白质，为此，必须使用表达系统来创建重组蛋白，但实验不起作用。因此，我们采用了锌敏感的p53蛋白，这是DNA结合金属蛋白的第二个候选者。 p53称为癌症抑制剂，是参与DNA复制，细胞生长和细胞分裂的蛋白质。由于许多p53突变体在癌细胞中积累，因此认为该蛋白质的正常功能抑制肿瘤和癌症的生长。这项研究旨在使用紫外线共振拉曼光谱法阐明p53在分子水平上的信息传递的机制。获得p53的cDNA，并通过PCR扩增DNA结合结构域，并将其掺入表达载体中以在大肠杆菌中构建表达系统。真核生物和原核生物之间的DNA转换代码子的偏好不同，因此人类衍生的p53在大肠杆菌中的表达很差。起初，我每升只能获得约0.2mg的蛋白质。因此，付出了巨大的努力来优化表达条件，并获得了原始的50倍。纯化的产物是载脂蛋白，不含金属，因此用Zn，Hg，Ni等重构该蛋白质。在肝素柱上纯化了蛋白质，并测量了质谱。它是单体和低聚物的混合物。通过SDS页面确定分子量，并使用纯单体部分测量吸收光谱。吸收最大值在235和280 nm处显示。我们已经成功测量了244nm激发的共振拉曼光谱。出现在Zn配合物中的拉曼条带不存在于peprotoins中，而是在911cm^<-1>中，并且归因于坐标为Zn的组氨酸的振动。另外，在Zn络合物中观察到184、222和260 cm^<-1>的拉曼条带。我们正在尝试查看229或206 nm的波长时，拉曼泵送光的波长如何变化。