紫外共鳴ラマン分光法によるDNA結合蛋MerRの金属錯体における金属種区別法の解明
阐明使用紫外共振拉曼光谱区分 DNA 结合蛋白 MerR 金属复合物中金属种类的方法
基本信息
- 批准号:03F03100
- 负责人:
- 金额:$ 0.77万
- 依托单位:
- 依托单位国家:日本
- 项目类别:Grant-in-Aid for JSPS Fellows
- 财政年份:2003
- 资助国家:日本
- 起止时间:2003 至 2004
- 项目状态:已结题
- 来源:
- 关键词:
项目摘要
DNA結合蛋白MerRを報告されている方法にしたがって単離・精製した。生化学的な活性を測定する量はこれで取れるが、分光学的測定を行うには大量に蛋白を取る必要があり、そのためには発現系を用いてリコンビナント蛋白を作る事が必須であるが、その実験がうまくいかなかった。そこでDNA結合金属蛋白の第2候補である亜鉛感受性p53蛋白を取り上げた。P53はガン抑制因子と呼ばれ、DNAの複製や細胞の成長、細胞の分裂などに関わる蛋白質である。ガン細胞にはp53の変異体が多く蓄積する事から、この蛋白質が正常に機能している事で腫瘍やガンの成長を抑制していると考えられる。本研究ではp53の情報伝達メカニズムを紫外共鳴ラマン分光法を用いて分子レベルで明らかにする事を目的とした。P53のcDNAを入手し、DNA結合ドメインをPCRで増幅して発現ベクターに組込んで大腸菌での発現系を構築した。DNAから蛋白質への翻訳コドンは真核生物と原核生物で好みが違うため、ヒト由来p53を大腸菌で発現させると発現効率が悪かった。初めは1L当り0.2mg程度の蛋白しか得られなかった。そこで発現条件の最適化にかなりの労力を投入し、当初の50倍の収量が得られるようになった。精製物は金属を含まないアポ蛋白質であったので、Zn、Hg、Ni等で蛋白を再構成した。それをヘパリンカラムで精製し、質量スペクトルを測定した。モノマーとオリゴマーの混合物であった。SDS PAGEで分子量を決め、モノマー部分を純粋にして吸収スペクトルを測定した。235と280nmに吸収極大を示した。その244nm励起の共鳴ラマンスペクトルを測定する事に成功した。アポ蛋白質には無くてZn錯体で初めて現れるラマンバンドが911cm^<-1>にあり、これをZnに配位するヒスチヂンの振動に帰属した。またZn錯体には、184、222、260cm^<-1>にラマンバンドが見られた。ラマン励起光の波長を229や206nmにするとそれらのバンドがどう変るかを実験しつつある。
根据报道的方法分离和纯化DNA结合蛋白MerR。虽然这可以产生足够的蛋白质来测量生化活性,但需要获得大量蛋白质用于光谱测量,并且为此目的必须使用表达系统创建重组蛋白质,但该实验没有成功。因此,我们重点关注锌敏感性 p53 蛋白,它是 DNA 结合金属蛋白的第二个候选蛋白。 P53 被称为癌症抑制因子,是一种参与 DNA 复制、细胞生长和细胞分裂的蛋白质。由于许多p53突变体在癌细胞中积累,因此人们认为这种蛋白质的正常功能可以抑制肿瘤和癌症的生长。本研究的目的是利用紫外共振拉曼光谱在分子水平上阐明p53的信息转导机制。我们获得了P53的cDNA,通过PCR扩增了DNA结合域,并将其插入表达载体中构建了大肠杆菌表达系统。由于真核生物和原核生物从 DNA 翻译成蛋白质的密码子偏好不同,因此当人源 p53 在大肠杆菌中表达时,表达效率较低。最初,每升只能获得约 0.2 毫克蛋白质。因此,我们投入了大量的精力来优化表达条件,现在产量比原来提高了50倍。由于纯化产物是不含金属的脱辅基蛋白,因此用Zn、Hg、Ni等对蛋白进行重构。用肝素柱纯化并测量其质谱。它是单体和低聚物的混合物。通过SDS PAGE测定分子量,纯化单体部分,并测量吸收光谱。它在 235 和 280 nm 处显示最大吸收。我们成功测量了244nm激发的共振拉曼光谱。在911cm^-1处有一条拉曼带,该带在脱辅基蛋白中不存在,但在Zn复合物中首次出现,我们将其归因于与Zn配位的组氨酸的振动。在Zn络合物中还在184、222和260cm ^ -1 处观察到拉曼带。我们目前正在试验当拉曼激发光的波长变为 229 或 206 nm 时这些谱带如何变化。
项目成果
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