紫外共鳴ラマン分光法によるDNA結合蛋白MerRの金属錯体における金属種区別法の解明

使用紫外共振拉曼光谱阐明 DNA 结合蛋白 MerR 金属复合物中金属种类的分化

基本信息

批准号：
03F00100
负责人：
北川禎三
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Okazaki National Research Institutes
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-03F00100/
关键词：
紫外共鳴ラマン p53 ガン抑制因子共鳴ラマン

项目摘要

本課題の研究対象であるDNA結合蛋白のなかで、まずMerRの単離精製を試みたがうまくいかなかったので、第2候補の亜鉛感受性p53蛋白を取り上げた.p53はガン抑制因子と呼ばれ、DNAの複製や細胞の成長、細胞の分裂などに関わる蛋白質である。ガン細胞にはp53の変異体が多く蓄積することから、この蛋白質が正常に機能していることで腫瘍やガンの成長を抑制していると考えられている。p53に関しては細胞レベルで多くの研究が行われているが、分子レベルでその機能を明らかにした研究は今のところない。そこで本課題ではp53の情報伝達メカニズムを紫外共鳴ラマン分光法を用い、分子レベルで明らかにする。American Type Culture Collectionより入手したヒトのp53のcDNAからDNA結合ドメインをPCRで増幅し、発現ベクターに組み込み、大腸菌での発現系を構築した。DNAから蛋白質への翻訳は3つのヌクレオチドからなるコドンを介して行われるが、真核生物と原核生物では同じアミノ酸でも好んで使用されるコドンが異なるため、真核生物の蛋白質を原核生物である大腸菌で発現させる場合、発現効率が悪いことがある。ヒト由来のp53を用いた本研究でも、発現量が極めて低く、初めは培地1Lあたり0.2mg程度の精製蛋白質しか得られなかった。そこで最適な大腸菌種の選択や発現条件の最適化を行うことで、当初の10倍以上である10mg/培地1L程度の収量が得られるようになった。精製蛋白質は金属を含まないアポ蛋白質だったので、ZnやCu,Niで再構成した。アポ蛋白質の紫外共鳴ラマンスペクトルを測定したところ1478cm^<-1>にトリプトファン由来と思われる強いバンドが観測されたが、Niを再構成した蛋白質では、1398cm^<-1>にシフトしていた。現段階ではまだ詳細を議論できる程の良質なスペクトルが得られていないので、今後は更に蛋白質の精製量を増やし、スペクトルを測定すると共に、変異体を作製し、p53の情報伝達メカニズムを明らかにしていく予定である。

在DNA结合蛋白（这是该任务的研究目标）中，我尝试了MERR，但它不起作用，因此我选择了第二个候选锌敏感性p53蛋白与DNA复制，细胞生长和细胞分裂有关的蛋白质。人们认为该蛋白质通常在起作用，因为p53突变体的数量会在癌细胞中积累，从而抑制肿瘤和癌症的生长。细胞水平上有许多关于p53的研究，但是没有研究揭示其在分子水平上的功能。因此，在此任务中，使用紫外线谐振拉曼光谱镜头在分子水平上揭示了p53的信息传递机制。用来自人类p53 cDNA的PCR扩增DNA键的结构域，该cDNA从使用PCR的美国型培养物中获得，并掺入表达载体中，并在大肠杆菌中构建了表达。从DNA到蛋白质的翻译是通过由三个核苷酸组成的密码子进行的，但是在真核和原代生物中，在同一氨基酸中使用的密码子是在大肠杆菌中表达的原始生物。在这项研究使用人源性p53的研究中，表达的量极低，起初仅获得了0.2 mg纯化的蛋白质。因此，通过选择最佳的结直肠物种并优化表达条件，可以获得约10 mg/培养基的产量，即10倍或更多。精制蛋白是一种不含金属的苹果蛋白，因此由Zn，Cu，Ni重建。当测量紫外线谐振拉曼光谱时，在1478cm^<-1>上观察到了一个似乎是从色氨酸衍生而来的强带，但是在重建Ni的蛋白质中，它转移到1398cm^<-1>。在此阶段，没有良好的频谱可以讨论细节，因此，将来我们将进一步增加蛋白质的纯净量，测量光谱，创建突变体并澄清p53信息传输机制。