錐体視細胞における早いリン酸化反応の分子機構

视锥细胞光感受器快速磷酸化的分子机制

基本信息

批准号：
14780511
负责人：
橘木修志
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14780511/
关键词：
視細胞錐体桿体細胞内情報伝達 GPCR GRK リン酸化酵素活性

项目摘要

本年度は、当初の計画通り、(1)「活性型光受容蛋白質のリン酸化反応速度の厳密測定」、および(2)「G蛋白質活性化反応の違いに関する解析」を行った。(1)を行うため、反応を迅速に停止する装置を作成し、これを用いてリン酸化反応の過程を高い時間分解能で測定した。その結果、錐体では桿体と比べるとリン酸化反応の速度が約20倍早いことが解った。錐体でリン酸化が早い原因を解析したところ、錐体のキナーゼ活性が桿体と比べると500倍も高いためであることが解った。そこで次に、錐体の高いキナーゼ活性は、錐体で発現しているキナーゼの量が多いためなのかどうかを検討したところ、錐体では桿体と比べると約10倍の量のキナーゼが発現していることを明らかにした。また、この量の違いに加えて、錐体型キナーゼは桿体型キナーゼよりも一分子あたり約50倍も活性が高いことが解った。以上のことから、錐体におけるキナーゼ活性の高さは、量・質の両面での違いから生じることが明らかになった。(2)「G蛋白質活性化反応の違いに関する解析」の予備実験を行ったところ、当初計画した細胞膜試料を用いた実験系では解析が困難であることが解った。そこで、計画を変更し、再構成系での実験を行うことにした。このため、錐体・桿体G蛋白質を精製する方法を確立し、今後の解析を可能にした。この他に、錐体・桿体の応答の回復速度の違いに関係する(1)Guanylate CyclaseによるcGMPの合成反応の速度、および(2)G蛋白質αサブユニットにおけるGTPase反応の速度が、2種類の細胞で異なっているかどうかを検討した。その結果、これらの反応についても錐体・桿体の応答特性に対応した性質の違いが見られた。今後、その分子メカニズムを解明していく予定である。

今年，如最初计划的那样，我们进行了（1）“严格测量活性光感受器蛋白的磷酸化速率”和（2）“ G蛋白激活反应差异的分析”。为了执行（1），创建了一种迅速停止反应的设备，并使用此方法以高时间分辨率测量了磷酸化反应过程。结果，发现锥体中的磷酸化速率比杆的速度快20倍。当分析锥体快速磷酸化的原因时，发现这是因为锥体的激酶活性比杆的激酶高500倍。接下来，我们研究了锥体的高激酶活性是否是由于锥体中表达的大量激酶，并揭示了在锥体中，在锥体中表达的激酶比在杆上表达约10倍。除了这种差异外，还发现锥形激酶每分子的活性比棒状激酶高约50倍。从上面的角度来看，锥体中的高激酶活性源于数量和质量的差异。（2）进行初步实验以“分析G蛋白激活反应的差异”，并发现使用最初计划的细胞膜样品在实验系统中很难进行分析。因此，我们决定更改计划并使用重建系统进行实验。因此，已经建立了一种纯化锥体ROD G蛋白的方法，使得分析未来成为可能。此外，我们研究了（1）（1）鸟烯酸酸酯环酶合成反应的速率以及（2）G蛋白α亚基中GTPase反应速率是否与两种细胞之间的锥杆反应率差异有关。结果，对于这些反应，还观察到了与锥和杆反应特征相对应的性质的差异。将来，我们计划阐明分子机制。