錐体視細胞における早いリン酸化反応の分子機構

视锥细胞光感受器快速磷酸化的分子机制

基本信息

批准号：
14780511
负责人：
橘木修志
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14780511/
关键词：
視細胞錐体桿体細胞内情報伝達 GPCR GRK リン酸化酵素活性

项目摘要

本年度は、当初の計画通り、(1)「活性型光受容蛋白質のリン酸化反応速度の厳密測定」、および(2)「G蛋白質活性化反応の違いに関する解析」を行った。(1)を行うため、反応を迅速に停止する装置を作成し、これを用いてリン酸化反応の過程を高い時間分解能で測定した。その結果、錐体では桿体と比べるとリン酸化反応の速度が約20倍早いことが解った。錐体でリン酸化が早い原因を解析したところ、錐体のキナーゼ活性が桿体と比べると500倍も高いためであることが解った。そこで次に、錐体の高いキナーゼ活性は、錐体で発現しているキナーゼの量が多いためなのかどうかを検討したところ、錐体では桿体と比べると約10倍の量のキナーゼが発現していることを明らかにした。また、この量の違いに加えて、錐体型キナーゼは桿体型キナーゼよりも一分子あたり約50倍も活性が高いことが解った。以上のことから、錐体におけるキナーゼ活性の高さは、量・質の両面での違いから生じることが明らかになった。(2)「G蛋白質活性化反応の違いに関する解析」の予備実験を行ったところ、当初計画した細胞膜試料を用いた実験系では解析が困難であることが解った。そこで、計画を変更し、再構成系での実験を行うことにした。このため、錐体・桿体G蛋白質を精製する方法を確立し、今後の解析を可能にした。この他に、錐体・桿体の応答の回復速度の違いに関係する(1)Guanylate CyclaseによるcGMPの合成反応の速度、および(2)G蛋白質αサブユニットにおけるGTPase反応の速度が、2種類の細胞で異なっているかどうかを検討した。その結果、これらの反応についても錐体・桿体の応答特性に対応した性質の違いが見られた。今後、その分子メカニズムを解明していく予定である。

今年，按照原计划，我们进行了（1）“严格测量激活的感光蛋白的磷酸化反应率”和（2）“G蛋白激活反应的差异分析”。为了执行（1），我们创建了一种快速停止反应的装置，并用它以高时间分辨率测量磷酸化过程。结果表明，视锥细胞中的磷酸化反应速率比视杆细胞中快约20倍。当我们分析视锥细胞磷酸化快速发生的原因时，我们发现这是因为视锥细胞中的激酶活性比视杆细胞高500倍。接下来，我们研究了视锥细胞中高激酶活性是否是由于视锥细胞中表达了大量激酶，结果发现视锥细胞表达的激酶大约是视杆细胞的10倍，我明确表示我正在这样做。除了数量上的差异外，锥型激酶的每个分子活性比杆型激酶高大约 50 倍。从上文可以清楚地看出，视锥细胞中高水平的激酶活性源于数量和质量的差异。 (2)“G蛋白活化反应的差异分析”的初步实验表明，原计划的使用细胞膜样品的实验系统很难进行分析。因此，我们决定改变计划并使用重新配置的系统进行实验。为此，我们建立了一种纯化视锥和视杆 G 蛋白的方法，使未来的分析成为可能。此外，还有另外两类反应与视锥反应和视杆反应的恢复速度差异有关：（1）鸟苷酸环化酶的cGMP合成反应的速度，以及（2）GTPase反应的速度我们研究了这对于每种类型的细胞是否不同。结果，观察到与视锥细胞和视杆细胞的响应特征相对应的这些响应的特性差异。未来，我们计划阐明其分子机制。