DNAトポイソメラ-ゼ機能の分子生物学的研究とその癌化学療法への応用

DNA拓扑异构酶功能的分子生物学研究及其在癌症化疗中的应用

基本信息

批准号：
03151078
负责人：
安藤俊夫
金额：
$ 10.88万
依托单位：
Aichi Cancer Center Research Institute
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Cancer Research
财政年份：
1991
资助国家：
日本
起止时间：
1991 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

真核生物のDNAは核マトリックスと呼ばれるDNAトポイソメラ-ゼ(トポ)IIを含む数種類の不溶性タンパク質から成る核内構造体と結合し、多数のル-プを形成している事が示されている。そしてマトリックスに結合するDNA部分(MAR)にはトポIIの結合配列が存在する。我々はMARを特異的に結合する120KDのタンパクのcDNAをクロ-ン化し配列を決定した。このタンパク質はDNA結合性のRGドメインとATPase活性を持つPル-プドメインから成っていた。ル-プDNAに超ラセンを導入するsupercoiling factor(SCF)がクロ-ン化され配列決定された。25%が酸性アミノ酸より成り、ジャイレ-スと相同部位、カルシュウム結合部位等が同定され、そのin vivo機能の解明が待たれる。ヒトトポIタンパクの機能部位の解析がなされた。765アミノ酸のうち、第231番から727番までの497アミノ酸残基が必須領域であり、中でも533番のアスパラギン酸は活性にとって重要である事が欠失変異及びカンプトテシン(CPT)耐性変異トポIの解析から示された。マウストポ及びトポIIがクロ-ン化され配列が決定された。その配列はそれぞれヒトトポIと96%、ヒトトポIIと89%の相同性であり、哺乳類間の著しい保存性の高さを示した。トポIIの機能に関して次の事が示された。トポIIは酵母のみならず哺乳類においても、染色体の凝縮と分離においてのみ細胞生存にとって必須の機能を果たしている事がトポIIの非切断性阻害剤によって初めて示された。また細胞周期においてトポIIが核内及び染色体上で著しくその局在性を変化させるという事実(モノクロ-ン抗体)も上記を裏付けている。トポI及びIIの特異的な阻害剤CPT及びVPー16に対する耐性細胞の研究において、それぞれ、酵素遺伝子の変異及び発現低下による耐性獲得である事が示された。

研究表明，真核 DNA 与核基质结合，核基质是一种由多种不溶性蛋白质组成的核内结构，其中包括 DNA 拓扑异构酶 (topo) II，形成许多环。与基质结合的 DNA 部分 (MAR) 包含拓扑 II 结合序列。我们克隆并测序了特异性结合 MAR 的 120KD 蛋白的 cDNA。该蛋白由 DNA 结合 RG 结构域和具有 ATP 酶活性的 P 环结构域组成。将超螺旋引入环状 DNA 的超螺旋因子 (SCF) 已被克隆并测序。它由25%的酸性氨基酸组成，与旋转酶同源的位点、钙结合位点等已被鉴定，我们期待阐明其体内功能。分析了人拓扑I蛋白的功能位点。在 765 个氨基酸中，第 231 至 727 位的 497 个氨基酸残基是必需的，特别是第 533 位的天冬氨酸对于活性很重要，如拓扑 I 的缺失突变和喜树碱 (CPT) 抗性突变体所示。由分析可知。对小鼠拓扑结构和拓扑结构 II 进行了克隆和测序。这些序列与人类拓扑 I 的同源性为 96%，与人类拓扑 II 的同源性为 89%，表明哺乳动物之间具有显着的保守程度。关于Topo II的功能如下所示。使用拓扑 II 的不可裂解抑制剂，首次证明拓扑 II 对细胞生存发挥重要作用，包括染色体浓缩和分离，不仅在酵母中，而且在哺乳动物中。此外，拓扑 II 在细胞周期中显着改变其在细胞核内和染色体上的定位（单克隆抗体）这一事实也支持上述观点。对拓扑异构酶 I 和 II 的特异性抑制剂 CPT 和 VP-16 具有抗性的细胞研究表明，获得抗性的原因分别是酶基因突变和表达减少。