鶏卵リゾチームの甘味発現機構に関する研究

鸡蛋溶菌酶甜味表达机制的研究

基本信息

批准号：
14760080
负责人：
桝田哲哉
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14760080/
关键词：
sweet-tasting protein lysozyme chemical modification positively charged residues mutation Pichia pastoris sweet lysine arginine isoelectric point basic proteins

项目摘要

一般的に精製されたタンパク質は味を呈さないが、例外的に甘味を呈するタンパク質が知られている。熱帯植物由来のソーマチン、モネリンは古くから甘味を呈することが知られており、ソーマチンは食品素材、風味増強剤として食品業界で利用されている。鶏卵卵白中に存在する溶菌酵素リゾチームもまた甘味を呈する。鶏卵卵白リゾチームは分子量14,500、分子内にリジン残基6残基、アルギニン残基11残基を有する等電点11の塩基性タンパク質であり、その甘味閾値は約7μMである。しかしながら、リゾチームのどの部位が甘味発現に重要な役割を担っているのかの知見はほとんどない。そこで本研究は、リゾチームの塩基性アミノ酸残基である、リジン及び、アルギニン残基にターゲットを絞り、化学修飾法、および遺伝子工学的手法を用いてリゾチームの甘味発現機構を明らかにすることを目的とした。まず化学修飾はリジン残基側鎖のε-アミノ基のグアニジル化(Gua)、アセチル化(Ac)、ホスホピリドキサール化(PLP)により行った。またAc化、PLP化したリゾチームについては、SP陽イオン交換カラムを用いて精製を行い、修飾度合いの異なる修飾体を得た。PLP化したリゾチームについては、再び脱リン酸化を行った。これらリゾチームの甘味特性評価は人による三点識別法にて行い、その甘味閾値を求めた。Guaリゾチームは甘味閾値にほとんど影響を与えなかったが、Ac及びPLPリゾチームの甘味閾値は修飾度合いが高まるにつれ顕著に増大した。また閾値の上昇したPLPリゾチームの脱リン酸化を行ったところ、再び甘味閾値が減少したことから、リゾチームの甘味発現にはリジン残基側鎖の構造的要因ではなく、塩基性度が重要であることが明らかになった。化学修飾法の結果を考慮し、メタノール資化性酵母Pichia pastorisを用い、部位特異的変異にて詳細に甘味発現に係わる残基を検討した。その結果、Lys13,Lys96,Arg14,Arg21,Arg73の5残基が甘味発現に重要な役割を果たすことが明らかとなった。

通常，精致的蛋白质不会味道，但已知异常甜的蛋白质。源自热带植物的Somachin和Monelin长期以来闻名，而Somachin在食品工业中被用作食品材料和风味促进剂。存在于白鸡蛋中的细菌酶liza团队也很甜。鸡蛋白色丽莎小组的分子量为14,500，分子分子中的线虫残基，6个LIDIN残基和11个精氨酸残基的11个残基，并且具有约7μm的甜度阈值。但是，几乎不知道Reson团队哪一部分在甜味表达中起着重要作用。因此，这项研究的目的是将靶标缩小为赖氨酸和精氨酸残基，这些残基是Liza团队的基本氨基酸残基，并使用化学修饰方法和基因工程方法阐明了Liza小组的甜度表达。我做到了。首先，化学修饰是由赖氨酸残基侧的ε-氨基组由圭亚那（GUA），乙酰化（AC）和磷酸吡啶毒素（PLP）进行的。在AC和PLP的情况下，使用SP阳性离子交换柱进行精炼以获得不同程度的修饰。对于PLP转换的Liza团队，它被重新氧化。这些资源对这些资源的甜度特征评估是通过一个人以三个点识别方法进行的，并获得了甜度阈值。 GUA响起的响声几乎不会影响甜度阈值，但是随着修饰程度的提高，AC和PLP Liza团队的甜阈值增加。此外，当阈值上升PLP Liza团队时，它不是赖氨酸残基侧链的结构因素，但其基础对于Liza团队的甜味很重要，但它不是赖氨酸残基侧链的结构因素这很清楚。考虑到《化学现代定律》的结果，使用甲醇加工后的酵母pichia patoris检查了部分与甜度有关的残留物。结果，据揭示了lys13，lys96，arg14，arg21和arg73在甜味表达中起着重要作用。