鶏卵リゾチームの甘味発現機構に関する研究

鸡蛋溶菌酶甜味表达机制的研究

基本信息

批准号：
14760080
负责人：
桝田哲哉
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14760080/
关键词：
sweet-tasting protein lysozyme chemical modification positively charged residues mutation Pichia pastoris sweet lysine arginine isoelectric point basic proteins

项目摘要

一般的に精製されたタンパク質は味を呈さないが、例外的に甘味を呈するタンパク質が知られている。熱帯植物由来のソーマチン、モネリンは古くから甘味を呈することが知られており、ソーマチンは食品素材、風味増強剤として食品業界で利用されている。鶏卵卵白中に存在する溶菌酵素リゾチームもまた甘味を呈する。鶏卵卵白リゾチームは分子量14,500、分子内にリジン残基6残基、アルギニン残基11残基を有する等電点11の塩基性タンパク質であり、その甘味閾値は約7μMである。しかしながら、リゾチームのどの部位が甘味発現に重要な役割を担っているのかの知見はほとんどない。そこで本研究は、リゾチームの塩基性アミノ酸残基である、リジン及び、アルギニン残基にターゲットを絞り、化学修飾法、および遺伝子工学的手法を用いてリゾチームの甘味発現機構を明らかにすることを目的とした。まず化学修飾はリジン残基側鎖のε-アミノ基のグアニジル化(Gua)、アセチル化(Ac)、ホスホピリドキサール化(PLP)により行った。またAc化、PLP化したリゾチームについては、SP陽イオン交換カラムを用いて精製を行い、修飾度合いの異なる修飾体を得た。PLP化したリゾチームについては、再び脱リン酸化を行った。これらリゾチームの甘味特性評価は人による三点識別法にて行い、その甘味閾値を求めた。Guaリゾチームは甘味閾値にほとんど影響を与えなかったが、Ac及びPLPリゾチームの甘味閾値は修飾度合いが高まるにつれ顕著に増大した。また閾値の上昇したPLPリゾチームの脱リン酸化を行ったところ、再び甘味閾値が減少したことから、リゾチームの甘味発現にはリジン残基側鎖の構造的要因ではなく、塩基性度が重要であることが明らかになった。化学修飾法の結果を考慮し、メタノール資化性酵母Pichia pastorisを用い、部位特異的変異にて詳細に甘味発現に係わる残基を検討した。その結果、Lys13,Lys96,Arg14,Arg21,Arg73の5残基が甘味発現に重要な役割を果たすことが明らかとなった。

纯化的蛋白质通常不会表现出味道，但已知非常甜的蛋白质。莫内林（Monellin）是一种源自热带植物的somatin，长期以来一直具有甜味，并且在食品工业中已将somatin用作食品成分和味道增强剂。蛋白中存在的溶菌酶也表现出甜味。蛋清溶菌酶是一种等电点11碱性蛋白，分子量为14,500，分子量为6个赖氨酸残基和11个精氨酸残基在该分子中，甜度阈值约为7μm。但是，几乎没有关于溶菌酶在甜味表达中起重要作用的知识。因此，这项研究旨在靶向赖氨酸和精氨酸残基，这些残基是溶菌酶的碱性氨基酸残基，并使用化学修饰方法和遗传工程技术阐明溶菌酶的甜度表达机制。首先，通过在赖氨酸残基侧链的ε-氨基基团的鸟苷化，乙酰化（AC）和磷酸吡啶氧化（PLP）中进行化学修饰。此外，使用SP阳离子交换柱将转换为ACIC或PLP转换为ACIC或PLP的溶菌酶以不同程度的修饰度获得修改产品。再次将PLP形成的溶菌酶去磷酸化。这些溶菌酶的甜度特征是使用一个人的三点鉴定方法评估的，并确定了甜度阈值。尽管GUA溶菌酶对甜度阈值的影响不大，但随着修饰程度的增加，AC和PLP溶菌酶的甜度阈值显着增加。此外，执行了PLP溶菌酶的去磷酸化，并再次降低了甜度阈值，这表明碱性很重要，而不是赖氨酸残基侧链的结构因子。考虑到化学修饰方法的结果，使用甲醇辅助酵母pichia Pastoris的定位突变详细研究了与甜度表达相关的残基。结果，揭示了五个残基Lys13，Lys96，arg14，arg21和arg73在甜味味道表达中起着重要作用。