ヘパラン硫酸6スルホトランスフェラーゼの基質認識機構の解明

硫酸乙酰肝素6磺基转移酶底物识别机制的阐明

基本信息

批准号：
14780476
负责人：
角田佳充
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

ヘパラン硫酸6スルホトランスフェラーゼは、ヘパラン硫酸鎖の生合成過程において、6位の水酸基に特異的に硫酸基を転移する反応を触媒する酵素である。本酵素は、ゴルジ体内に局在しており、ヘパラン硫酸鎖生合成過程における最終段階の修飾を行っていると考えられている。6位の硫酸基が、ヘパラン硫酸鎖の様々な生理活性に必須であることがわかっており、この修飾反応のメカニズムを詳細に解明することは、糖鎖生物学的にも重要であると考えられる。本実験は、ヘパラン硫酸6スルホトランスフェラーゼについてX線結晶構造解析を行うことで、その立体構造を明らかにして、基質特異性と反応メカニズムの両方について、その立体構造基盤を明らかにすることを目指した。本研究期間において、ヒト由来HS6STの大腸菌での大量発現系を作成した。4種類に発現ベクターを用いて、発現系を構築し、それらの培養条件について検討した。又、精製法についても、それぞれ最適化を行った。精製法には、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーを用いた。その結果、最高で1L培養あたり1mg程度の精製タンパク質を得ることに成功した。本精製サンプルは酵素活性を示したことから、結晶化用サンプルとして用いることができた。結晶化のスクリーニングは、ハンギングドロップ蒸気拡散法およびシッティングドロップ蒸気拡散法を併用した。2000条件以上の結晶化条件の検索を行ったが、X線回折実験に使用できる結晶を作成するには至らなかった。

硫酸乙酰肝素6磺基转移酶是在硫酸乙酰肝素链的生物合成过程中催化将硫酸基特异性转移至6位羟基的反应的酶。这种酶位于高尔基体内，被认为在硫酸乙酰肝素链生物合成过程中进行最后阶段的修饰。已知6位的硫酸基对于硫酸乙酰肝素链的各种生理活性是必需的，并且从糖生物学的角度详细阐明该修饰反应的机制是重要的。本实验旨在通过X射线晶体结构分析阐明硫酸乙酰肝素6磺基转移酶的三维结构，阐明底物特异性和反应机制的三维结构基础。在此研究期间，我们在大肠杆菌中创建了人源 HS6ST 的大规模表达系统。使用四种表达载体构建表达系统，并研究其培养条件。此外，还对纯化方法进行了优化。使用亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析进行纯化。结果，我们成功地每 1L 培养物最多获得约 1mg 的纯化蛋白。由于该纯化样品显示出酶活性，因此可以将其用作结晶样品。结晶筛选采用悬滴蒸气扩散法和坐滴蒸气扩散法的组合。尽管我们搜索了2000多种结晶条件，但仍无法制造出可用于X射线衍射实验的晶体。