CRFにより発現誘導される新規遺伝子の検索;CRFノックアウトマウスを用いて

利用CRF基因敲除小鼠寻找CRF诱导表达的新基因；

• 批准号: 14770590
• 负责人: 笠木 陽子
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Nippon Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14770590/
• 关键词: Corticotropin-releasing factor(CRF); CRF-R1; PCR-Select cDNA Subtraction法; CRFノックアウトマウス; 視床下部; 小脳

本研究はCorticotropin-releasing factor(CRF)の未知の作用を明らかにする事を目的に、CRFの1型受容体(CRF-R1)を発現している組織でCRFにより発現が誘導される遺伝子を、CRFノックアウトマウス、PCR-Select cDNA Subtraction法を用いて検索、同定したものである。これにより現在までその発現がCRFにより誘導されることが知られていなかった遺伝子が同定され、CRFの新たな役割を明らかにしうるものと考えられる。CRFノックアウトマウス(KO)は当教室にて継代したものを用い、C57BL系マウス(野生株)(WT)をコントロールとし、両者に対し副腎摘除をしたうえで実験に用いた。副腎摘除術後7日目に両者を無麻酔下に断頭屠殺し、小脳及び視床下部を摘出した。断頭時に採血を行い、血中ACTH、コルチコステロン濃度を測定し、副腎摘除が確実に行われていることを確認した。摘出した小脳よりmRNAを抽出し、PCR-Select cDNA Subtraction法を用いてWTで多く叉は選択的に発現しているcDNA群を選択的に増幅し、subtraction cDNAライブラリーを作製した。得られたcDNAをプローブにDifferential Screeningを行い、WTの小脳でKOに比較して発現が増加している25個のクローンを得た。そのうち16個(64%)は既知遺伝子と高い相同性を有しており、いつくかは神経形成、神経細胞死、神経伝達などの神経系の機能に関与している遺伝子であった。さらにNorthern解析及びin situ hybridizationにより各遺伝子の発現量の差の確認を行い、Cyclin I遺伝子の小脳における発現がCRF依存性であることが明かとなり、今後その生理学的意義、発現調節機構につき検討予定である。

本研究旨在阐明促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）的未知作用，并在表达CRF 1型受体（CRF-R1）（CRF敲除小鼠）的组织中鉴定由CRF诱导表达的基因。使用 PCR-Select cDNA 扣除方法。这将导致迄今为止未知其表达是由CRF诱导的基因的鉴定，并可能揭示CRF的新作用。本实验室传代CRF基因敲除小鼠（KO），以C57BL小鼠（野生株）（WT）作为对照，两只小鼠在用于实验前均被切除肾上腺。肾上腺切除术后7天，将两只动物斩首并在没有麻醉的情况下处死，并切除小脑和下丘脑。在断头时采集血液，并测量血液ACTH和皮质酮浓度以确认肾上腺切除术已正确进行。从切除的小脑中提取mRNA，并使用PCR-Select cDNA Subtraction方法选择性扩增WT中丰富或选择性表达的cDNA组，以创建扣除cDNA文库。使用获得的cDNA作为探针进行差异筛选，获得25个与KO相比WT小脑中表达增加的克隆。其中，16个（64%）与已知基因具有高度同源性，其中一些基因涉及神经发生、神经细胞死亡和神经传递等神经系统功能。此外，我们通过Northern分析和原位杂交证实了各基因表达水平的差异，发现小脑中Cyclin I基因的表达具有CRF依赖性。我们计划在小脑中研究其生理意义和表达调控机制。是的。