CRFにより発現誘導される新規遺伝子の検索;CRFノックアウトマウスを用いて

利用CRF基因敲除小鼠寻找CRF诱导表达的新基因；

• 批准号: 14770590
• 负责人: 笠木 陽子
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Nippon Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14770590/
• 关键词: Corticotropin-releasing factor(CRF); CRF-R1; PCR-Select cDNA Subtraction法; CRFノックアウトマウス; 視床下部; 小脳

本研究はCorticotropin-releasing factor(CRF)の未知の作用を明らかにする事を目的に、CRFの1型受容体(CRF-R1)を発現している組織でCRFにより発現が誘導される遺伝子を、CRFノックアウトマウス、PCR-Select cDNA Subtraction法を用いて検索、同定したものである。これにより現在までその発現がCRFにより誘導されることが知られていなかった遺伝子が同定され、CRFの新たな役割を明らかにしうるものと考えられる。CRFノックアウトマウス(KO)は当教室にて継代したものを用い、C57BL系マウス(野生株)(WT)をコントロールとし、両者に対し副腎摘除をしたうえで実験に用いた。副腎摘除術後7日目に両者を無麻酔下に断頭屠殺し、小脳及び視床下部を摘出した。断頭時に採血を行い、血中ACTH、コルチコステロン濃度を測定し、副腎摘除が確実に行われていることを確認した。摘出した小脳よりmRNAを抽出し、PCR-Select cDNA Subtraction法を用いてWTで多く叉は選択的に発現しているcDNA群を選択的に増幅し、subtraction cDNAライブラリーを作製した。得られたcDNAをプローブにDifferential Screeningを行い、WTの小脳でKOに比較して発現が増加している25個のクローンを得た。そのうち16個(64%)は既知遺伝子と高い相同性を有しており、いつくかは神経形成、神経細胞死、神経伝達などの神経系の機能に関与している遺伝子であった。さらにNorthern解析及びin situ hybridizationにより各遺伝子の発現量の差の確認を行い、Cyclin I遺伝子の小脳における発現がCRF依存性であることが明かとなり、今後その生理学的意義、発現調節機構につき検討予定である。

这项研究旨在阐明皮质激素释放因子（CRF）的未知作用，并使用PCR选择的cDNA减法方法搜索使用CRF敲除小鼠和PCR-elect cDNA cDNA亚验证方法在表达CRF类型1受体（CRF-R1）的CRF诱导的基因。这可以识别出直到现在尚未被CRF诱导的基因，并且认为CRF的新作用可以揭示出来。 CRF敲除小鼠（KO）在我们的教室中传递，C57BL小鼠（野生菌株）（WT）用作对照组，并且在实验中使用之前，对两者进行了肾上腺切除术。在肾上腺切除术后的第7天，在麻醉下斩首，小脑和下丘脑被去除。在斩首时收集血液，并测量血液ACTH和皮质酮水平，并确认肾上腺切除术可靠地进行。从切除的小脑中提取mRNA，并选择性地放大cDNA基团，这些cDNA基团主要或选择性地使用PCR选择的cDNA减法方法在WT中表达，以生成减法cDNA库。将获得的cDNA作为探针进行差异筛选，以获得25个克隆，与KO相比，在WT小脑中表达增加。其中，有16个（64％）与已知基因具有很高的同源性，并且是与神经发生，神经元细胞死亡和神经传递等神经系统功能有关的基因。此外，通过北方分析和原位杂交证实了每个基因的表达水平的差异，并且揭示了细胞周期蛋白I基因在小脑中的表达是CRF依赖性的，并且将来将研究表达调节的生理意义和机制。