未熟な造血細胞に発現する新規の5回膜貫通型分子M83の機能の解析

未成熟造血细胞中表达的新型五次跨膜分子M83的功能分析

基本信息

批准号：
14770528
负责人：
本橋力
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Gifu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は未熟なヒト血液細胞であるF36P細胞から新規に同定した細胞膜上発現分子であるM83分子の機能を解析するものである。M83分子は既知の分子と全く類似性がない新しい分子であるため、遺伝子ターゲティングマウスを作成して、その機能を調べるのが効果的であると考えた。昨年度においては、M83遺伝子のゲノム構造を明らかにし、細胞膜貫通領域と細胞内領域をコードしている10〜13番目のエクソンを欠損できるようなターゲティングベクターを作製した。本年度においてはこのターゲティングベクターを相同組み換えによりES細胞E14-1に組み入れ、M83遺伝子欠損ES細胞を5クローン作製することができた。また、このES細胞をマウス初期胚に導入して、キメラマウスの作製にも成功した。現在、導入したES細胞がキメラマウス内で生殖系列に分化できるかどうかを確認中であり、確認でき次第、ヘテロとホモのM83遺伝子欠損マウスを作成する予定である。M83の臓器での発現はRT-PCRによって腎臓、肺、肝臓、脾臓、リンパ節、胸腺、骨髄で強く認められる。このことからM83の抗体を作製して免疫組織染色をおこなって実際の臓器での発現を詳細に調べようと考えた。M83の細胞内領域C末端の12アミノ酸からなるペプチドを合成し、これを用いてウサギを免役して、M83細胞内領域に対するポリクローナル抗体の作成に成功した。このポリクローナル抗体を用いて各種の組織切片の免疫染色を現在実行中である。同時にM83に対するモノクローナル抗体の作成にも着手しているが、本年度においてはラットの免疫に用いるM83細胞外領域とのFcキメラタンパク質の精製を試みた。

本研究分析了 M83 的功能，M83 是一种新鉴定的分子，在 F36P 细胞（未成熟的人类血细胞）的细胞膜上表达。由于M83分子是一种新分子，与已知分子没有相似之处，我们认为创建基因靶向小鼠并检查其功能将是有效的。去年，我们阐明了M83基因的基因组结构，并创建了一个可以删除编码跨膜和细胞内区域的外显子10至13的靶向载体。今年，我们通过同源重组将该靶向载体整合到ES细胞E14-1中，并能够创建5个M83基因缺陷ES细胞克隆。他们还通过将这些 ES 细胞引入早期小鼠胚胎中，成功地培育出了嵌合小鼠。我们目前正在确认引入的ES细胞是否可以在嵌合小鼠中分化成种系，一旦证实这一点，我们计划创建杂合子和纯合子M83基因缺陷小鼠。通过RT-PCR，在肾、肺、肝、脾、淋巴结、胸腺和骨髓中强烈观察到M83在器官中的表达。基于此，我们决定制备M83抗体并进行免疫组织学染色，以详细研究其在实际器官中的表达。我们合成了M83胞内区C端由12个氨基酸组成的肽，并用该肽免疫兔子，成功制备了针对M83胞内区的多克隆抗体。我们目前正在使用这种多克隆抗体对各种组织切片进行免疫染色。同时，我们已经开始制备针对M83的单克隆抗体，今年我们尝试纯化具有M83胞外结构域的Fc嵌合蛋白，用于大鼠免疫。