単一グルタミン酸受容体チャネルにおけるカルシウムイオン流入過程の画像化

对单个谷氨酸受体通道中的钙离子流入过程进行成像

• 批准号: 13780633
• 负责人: 櫻井 孝司
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Hamamatsu University School of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13780633/
• 关键词: グルタミン酸; カルシウム; イオンチャネル; エバネッセンス顕微鏡; 正倒両立顕微鏡; 海馬; レーザー光分解; 全反射照明; マイクロフォトリシス; 正倒両立式顕微鏡; レーザー顕微鏡

平成14年度は局所レーザー光分解(FLIP)と全反射照明(TIRF)法の二目的を両立した正倒両立式蛍光顕微鏡法を用いて、1)神経細胞の細胞膜領域に限局したカルシウム応答をの検出、2)単一グルタミン酸イオンチャネルにおけるカルシウムイオン流入の同定を行なった。海馬神経細胞におけるグルタミン酸依存性Ca応答の領域を限局させるために、負荷するCa蛍光プローブの用量を低下させ、阻害剤を用いて他の(二次的な)Ca信号をできるだけ抑制することを試みた。3種の阻害剤、すなわちNMDA型受容体阻害剤であるMK-801(10μM)、膜電位依存性Caチャネル阻害剤であるニフェジピン(10μM)そして細胞膜透過型のCaキレート剤であるBAPTA-AM(20μM)を処置するとケージドグルタミン酸(1mM)のFLIPにより誘導されるCa依存性Rhod2蛍光は著しく阻害された。TIRF法で蛍光検出を細胞膜領域に限定するとグルタミン酸刺激直後において、グルタミン酸の投与領域(直径約3ミクロンの範囲)周辺に集中した蛍光強度の増大が検出された。蛍光強度はグルタミン酸投与後12msでピークに達し、この時平均直径約0.5ミクロンのスポットとして観察された。スポットは一度のグルタミン酸刺激で、9μm平方あたり平均で3〜10個ほど出現し、出現から20ms後にはほとんどが消滅した。スポットの直径は消失まで大きく変化しなかった。グルタミン酸刺激依存性で出現するCa依存性Rhod2スポットの数は、グルタミン酸の投与範囲や投与用量に依存して変化した。以上の結果から、グルタミン酸刺激依存性で出現したスポットはCaイオンの結合により活性化した単一のRhod2蛍光分子であると結論された。スポットはTIRF法でのみ観察されたことから、Rhod2蛍光分子がガラス面(細胞接着面)に近づいたときに検出されたと考えられ、カルシウムチャネルが開いてカルシウムイオンが細胞内に入ってRhod2と結合した瞬間をとらえた可能性が高い。

2002年，我们采用正向倒置荧光显微镜方法，结合了局部激光光解（FLIP）和全内反射照明（TIRF）的双重目的，1）检测神经元细胞膜区域的钙反应2）识别；单个谷氨酸离子通道中钙离子的流入。为了定位海马神经元中谷氨酸依赖性 Ca 反应的区域，我们降低了负载的 Ca 荧光探针的剂量，并尝试使用抑制剂尽可能抑制其他（次级）Ca 信号。使用三种抑制剂：MK-801 (10 μM)（一种 NMDA 型受体抑制剂）、硝苯地平 (10 μM)（一种膜电压依赖性 Ca 通道抑制剂）和 BAPTA-AM (10 μM)（一种细胞膜渗透性 Ca 离子） 20 μM 处理可显着抑制由笼状谷氨酸 (1 mM) 的 FLIP 诱导的 Ca 依赖性 Rhod2 荧光。当使用TIRF方法将荧光检测限于细胞膜区域时，在谷氨酸刺激后立即检测到集中在谷氨酸施用区域（直径约3微米）周围的荧光强度的增加。施用谷氨酸后12ms荧光强度达到峰值，此时观察到平均直径约为0.5微米的斑点。平均而言，单次谷氨酸刺激后，每 9 μm 见方会出现 3 至 10 个斑点，并且大多数斑点在出现 20 毫秒后消失。光斑的直径没有明显变化，直至消失。谷氨酸刺激时出现的Ca依赖性Rhod2斑点的数量根据谷氨酸的施用范围和剂量而变化。从以上结果可以得出结论，出现的依赖于谷氨酸刺激的斑点是通过与Ca离子结合而激活的单个Rhod2荧光分子。由于仅通过TIRF法观察到斑点，因此认为当Rhod2荧光分子接近玻璃表面(细胞粘附表面)时，钙通道打开，钙离子进入细胞并与Rhod2结合。他很有可能捕捉到了他这样做的那一刻。