進化分子工学によるエストロゲン様物質センサータンパク質の創出

通过进化分子工程创建类雌激素物质传感器蛋白

基本信息

批准号：
13760236
负责人：
土居信英
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13760236/
关键词：
進化分子工学タンパク質工学遺伝子工学バイオセンサー

项目摘要

本年度は,エストロゲンレセプターの分子結合部位を含むドメインをアルカリホスファターゼに挿入した融合タンパク質の機能・構造解析を行った.それらの遺伝子にランダム変異を導入し,エストロゲン様物質に対するセンサータンパク質のスクリーニングを行った.(1)挿入型融合タンパク質の発現・精製および機能・構造解析前年度に構築した10種類の挿入型融合タンパク質,すなわち,アルカリホスファターゼの立体構造上表面に位置する5つの部位(アミノ酸残基番号:189,250,315,360,408)に,2ないし11アミノ酸残基の2通りのリンカーを介して,エストロゲンレセプターを挿入したタンパク質を,それぞれ大腸菌内で発現したところ,すべて不溶性画分に存在した.それらを変性条件下で精製し巻き戻したタンパク質について,エストラジオール存在下および非存在下でホスファターゼ活性を測定したところ,すべて活性は検出できなかった.それらの円二色性測定を行ったところ,二次構造含量がかなり低下していたことから,タンパク質の巻き戻しが不十分であることが示唆された.(2)センサータンパク質のスクリーニングそこで,上記10種類の融合タンパク質にランダム変異を導入して,前年度に用意した,PVDF膜を用いたスクリーニング系を用いて,エストラジオール存在下でホスファターゼ活性を示すコロニーのスクリーニングを試みた.ランダム点変異の導入は,Error-prone PCR法で行った.このPCR産物を制限酵素で消化してベクターに連結し,挿入型融合タンパク質の変異体遺伝子ライブラリーを作製した.このライブラリーを大腸菌に導入したコロニーをPVDF膜に転写し,ホスファターゼ活性を示すコロニーをスクリーニングした.しかし,選択されたコロニーの活性は宿主由来のものばかりで,目的の変異体を得ることはできなかった.現在,スクリーニング系の改良を行っている.

今年，我们分析了一种融合蛋白的功能和结构，其中含有雌激素受体分子结合位点的结构域被插入到碱性磷酸酶中。我们在这些基因中引入了随机突变，并筛选了雌激素样物质的传感器蛋白。 1）上一年插入融合蛋白的表达、纯化和功能/结构分析同时构建的10种插入型融合蛋白，即位于碱性磷酸酶三维表面的5个位点（氨基酸残基编号：189、250、315、360、408），通过两个然后，我们在大肠杆菌中表达了插入雌激素受体的每种蛋白质。当在存在和不存在雌二醇的情况下测量在变性条件下纯化和重绕的蛋白质的磷酸酶活性时，在所有这些蛋白质中都检测不到活性。当我们进行颜色测量时，我们发现二级结构含量显着降低，表明蛋白质解旋不充分。 (2)传感器蛋白的筛选因此，我们在上述10种融合蛋白中引入了随机突变，并使用前一年制备的PVDF膜的筛选系统来检测雌二醇存在下的磷酸酶，我们尝试筛选显示出的菌落。引入随机点突变是一种容易出错的方法。将该PCR产物用限制酶消化并连接至载体以创建插入型融合蛋白的突变基因文库，并将该文库导入大肠杆菌中，并将菌落转移至PVDF膜上。显示出磷酸酶活性。然而，所选菌落的活性大部分来自于宿主，我们无法获得所需的突变体。目前，我们正在致力于完善筛选系统。