進化分子工学によるエストロゲン様物質センサータンパク質の創出

通过进化分子工程创建类雌激素物质传感器蛋白

基本信息

批准号：
13760236
负责人：
土居信英
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13760236/
关键词：
進化分子工学タンパク質工学遺伝子工学バイオセンサー

项目摘要

本年度は,エストロゲンレセプターの分子結合部位を含むドメインをアルカリホスファターゼに挿入した融合タンパク質の機能・構造解析を行った.それらの遺伝子にランダム変異を導入し,エストロゲン様物質に対するセンサータンパク質のスクリーニングを行った.(1)挿入型融合タンパク質の発現・精製および機能・構造解析前年度に構築した10種類の挿入型融合タンパク質,すなわち,アルカリホスファターゼの立体構造上表面に位置する5つの部位(アミノ酸残基番号:189,250,315,360,408)に,2ないし11アミノ酸残基の2通りのリンカーを介して,エストロゲンレセプターを挿入したタンパク質を,それぞれ大腸菌内で発現したところ,すべて不溶性画分に存在した.それらを変性条件下で精製し巻き戻したタンパク質について,エストラジオール存在下および非存在下でホスファターゼ活性を測定したところ,すべて活性は検出できなかった.それらの円二色性測定を行ったところ,二次構造含量がかなり低下していたことから,タンパク質の巻き戻しが不十分であることが示唆された.(2)センサータンパク質のスクリーニングそこで,上記10種類の融合タンパク質にランダム変異を導入して,前年度に用意した,PVDF膜を用いたスクリーニング系を用いて,エストラジオール存在下でホスファターゼ活性を示すコロニーのスクリーニングを試みた.ランダム点変異の導入は,Error-prone PCR法で行った.このPCR産物を制限酵素で消化してベクターに連結し,挿入型融合タンパク質の変異体遺伝子ライブラリーを作製した.このライブラリーを大腸菌に導入したコロニーをPVDF膜に転写し,ホスファターゼ活性を示すコロニーをスクリーニングした.しかし,選択されたコロニーの活性は宿主由来のものばかりで,目的の変異体を得ることはできなかった.現在,スクリーニング系の改良を行っている.

今年，我们对融合蛋白进行了功能和结构分析，其中将含有雌激素受体分子结合位点的结构插入碱性磷酸酶中。我们将随机突变引入这些基因中，并筛选了传感器蛋白作为雌激素样物质。 (1) Expression, purification and functional and structural analysis of 10 insertion fusion proteins constructed in the previous year, namely, proteins with estrogen receptor inserted into five sites (amino acid residue numbers: 189,250,315,360,408) located on the surface of the steric structure of alkaline phosphatase were expressed in Escherichia coli, each of which was expressed in 2 to 11氨基酸残基。所有这些都存在于不溶性的部分中。在存在下纯化的蛋白质和未发现的蛋白质的存在和不存在雌二醇的情况下测量了磷酸酶活性，并且未检测到所有蛋白质。圆二色性测量结果表明，二级结构含量显着降低，表明蛋白质的倒带不足。（2）筛选传感器蛋白。因此，将随机突变引入上述10种融合蛋白中，并使用上一年制备的PVDF膜使用筛选系统，我们试图筛选在雌二醇存在下表现出磷酸酶活性的菌落。随机点突变的引入非常容易发生。执行了此PCR方法。用限制酶消化该PCR产物，并将其连接到载体中，以创建插入融合蛋白的突变基因库。引入大肠杆菌的菌落被转移到PVDF膜上，并筛选出表现出磷酸酶活性的菌落。但是，所选菌落的活性仅限于宿主来源，因此无法获得靶突变体。目前，筛选系统正在改善。