食品タンパク質の経口投与により誘導される不応答化T細胞の特性の分子生物学的解析

口服食物蛋白诱导无反应T细胞特征的分子生物学分析

基本信息

批准号：
13760098
负责人：
伊勢渉
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

1)不応答化T細胞に特異的に発現する遺伝子の探索抗原の経口投与により誘導された不応答化T細胞とコントロールT細胞(抗原の非経口投与により誘導されたT細胞)間でsubtractive hybridization法を行うことにより、不応答化T細胞に特異的に発現する遺伝子クローニングした。Differential screeningを行うことにより、擬陽性クローンを排除した。候補クローンについては塩基配列の解析を行った。さらに定量的RT-PCR法を行うことにより、候補クローンの発現特異性について検討し、候補の絞り込みを行った。現在、候補クローンについて全長cDNAのクローニングを行っているところである。2)不応答化T細胞の抗原認識とシグナル伝達不応答化T細胞を抗原/抗原提示細胞で刺激し、raftにおけるシグナル伝達について検討した。すなわちT細胞を非イオン性界面活性剤であるBrij98で可溶化した後、ショ糖密度勾配遠心法によりraft画分を分離した。raft画分に含まれるシグナル伝達分子についてはwestern blotting法により解析した。その結果、コントロールT細胞においては抗原刺激依存的にraftに局在するT細胞レセプター(TCR)、ZAP70、LATなどのシグナル伝達分子の量が増加するのに対し、不応答化T細胞ではこれらシグナル伝達分子の量の増加は認められなかった。さらに共焦点レーザー顕微鏡を用いてTCR、raftマーカーGM1の細胞膜上の局在を調べたところ、コントロールT細胞とは異なり、不応答化T細胞ではTCRやGM1が抗原提示細胞との接触面に局在しているものが少なかった。以上より、不応答化T細胞はraftの局在、raftにおけるシグナル伝達制御に障害があることが示された。

1) 寻找在无反应 T 细胞中特异性表达的基因口服抗原诱导的无反应 T 细胞与对照 T 细胞（肠胃外施用抗原诱导的 T 细胞）之间的消减杂交通过执行此方法，我们克隆了特异性表达的基因在无反应的 T 细胞中。通过差异筛选消除假阳性克隆。对候选克隆进行核苷酸序列分析。此外，通过进行定量RT-PCR，我们检查了候选克隆的表达特异性并缩小了候选克隆的范围。我们目前正在克隆候选克隆的全长 cDNA。 2）无反应T细胞的抗原识别和信号转导我们用抗原/抗原呈递细胞刺激无反应T细胞并研究筏中的信号转导。即，用非离子表面活性剂Brij98溶解T细胞后，通过蔗糖密度梯度离心分离筏级分。通过蛋白质印迹分析筏级分中包含的信号转导分子。结果，在对照T细胞中，位于筏中的T细胞受体（TCR）、ZAP70和LAT等信号分子的数量以抗原刺激依赖性方式增加，而在无反应的T细胞中，这些信号没有增加观察转移分子的量。此外，当我们使用共聚焦激光显微镜研究 TCR 和筏标记 GM1 在细胞膜上的定位时，我们发现，与对照 T 细胞不同，TCR 和 GM1 定位在无反应 T 细胞中与抗原呈递细胞的接触表面。存在的东西很少。上述结果表明，无反应的T细胞在筏定位和筏信号转导调节方面存在缺陷。