新規耐熱性β-ガラクトシダーゼのX線結晶構造解析

新型耐热β-半乳糖苷酶的X射线晶体结构分析

基本信息

批准号：
13760058
负责人：
伏信進矢
金额：
$ 1.34万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度には、新規好熱菌由来β-ガラクトシダーゼ(A4-βGal)の結晶構造を解明することに成功し、nativeおよびガラクトース複合体構造において1.6Åおよび2.2Å分解能の構造がそれぞれ得られた。本構造は、糖質加水分解酵素ファミリー42としては世界初の立体構造であった。本年度は、この構造のさらに詳細な解析と、その結果の国際誌への論文発表を行い、さらに、活性が大幅に上昇した変異体の機能解析・立体構造解析を行った。A4-βGalは植木鉢状の3量体構造をとっており、全体の約20%を占める接触面において強い相互作用で結びついていた。本酵素が産業上有用な酵素である所以であるところの高い耐熱性は、この強力な相互作用によるものであることが推測された。また、活性部位の形成に、隣のサブユニットの残基が関与しており、活性の発現にも3量体化が必要であることが分かった。このように多量体化により活性部位を形成している例は糖質加水分解酵素の中では初めての例であった。なお、ガラクトースの認識機構は、構造既知の大腸菌βガラクトシダーゼとは全く異なっており、新規の基質認識機構が発見された。さらに、A4-βGalの反応機構はアノマー保持機構に従うことを、ファミリー42酵素では初めて、実験的に証明した。しかし、驚くべきことに、本酵素の全体的な立体構造は、本酵素と全く異なる反応機構(アノマー反転機構)に従うβアミラーゼとよく似ていた。従って、本酵素は糖質分解酵素で普遍的に見られる(α/β)8バレルの進化の上で特異な存在であることが明らかになった。これまで、共同研究者の大津らにより、本酵素の活性が大幅に上昇する変異体(P317S, H323Yおよびそれらの2重変異体)が得られていたが、我々はこれらの機能解析により、P317Sでk_<cat>の上昇、H323YでK_mの減少が起こり、2重変異体ではk_<cat>/K_mで約5.5倍の活性上昇が引き起こされることを見いだした。現在、2重変異体で1.8Å分解能の立体構造を得ており、変異の導入に伴う構造変化が活性中心残基へ伝わることにより、活性の上昇が引き起こされることを見いだしている。本研究の成果の一部は、「応用糖質科学誌」、Journal of Molecular Biology、「構造生物」に掲載された。現在、活性の上昇した変異体の機能・構造解析に関する論文の投稿を準備中である。

去年，我们成功阐明了一种新型嗜热菌衍生的β-半乳糖苷酶（A4-βGal）的晶体结构，并分别获得了1.6 Å和2.2 Å分辨率的天然结构和半乳糖复合物结构。该结构是世界上第一个碳水化合物水解酶家族 42 的三维结构。今年，我们对该结构进行了更详细的分析，并在国际期刊上发表了有关结果的论文，并对活性显着增强的突变体进行了功能和三维结构分析。 A4-βGal具有花盆状三聚体结构，在接触面通过强相互作用结合，约占总数的20%。据推测，这种强相互作用是该酶具有高热稳定性的原因，这使其成为工业上有用的酶。还发现邻近亚基的残基参与活性位点的形成，并且三聚化也是活性表达所必需的。这是碳水化合物水解酶之间多聚化形成活性位点的第一个例子。该半乳糖识别机制与已知结构的大肠杆菌β-半乳糖苷酶完全不同，并且发现了一种新的底物识别机制。此外，我们首次通过实验证明家族42酶的A4-βGal的反应机制遵循端基异构体保留机制。然而，令人惊讶的是，这种酶的整体三维结构与β-淀粉酶非常相似，但遵循完全不同的反应机制（端基异构体反转机制）。因此，表明该酶在碳水化合物降解酶中普遍存在的(α/β)8-桶的进化中是独特的。此前，我们的合作研究员 Otsu 等人获得了显着增加该酶活性的突变体（P317S、H323Y 及其双突变体），我们发现 k_<cat> 随 H323Y 增加，K_m 随 H323Y 减少，并且在双突变体中，k_<cat>/K_m 导致活性增加约 5.5 倍。我们目前获得了分辨率为1.8 Å的双突变体的3D结构，并发现与引入突变相关的结构变化被传递到活性中心残基，导致活性增加。这项研究的部分结果发表在《应用糖科学杂志》、《分子生物学杂志》和《结构生物学杂志》上。我们目前正在准备提交一篇关于活性增强的突变体的功能和结构分析的论文。