バキュロウイルス発現蛋白のELISA法を用いた抗デスモコリン自己抗体の研究

杆状病毒表达蛋白ELISA法研究抗桥粒胶蛋白自身抗体

基本信息

批准号：
13670905
负责人：
駒井礼子
金额：
$ 1.54万
依托单位：
Kurume University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒトDsc1,Dsc2,Dsc3の全長cDNAをtemplateとして用いて、それぞれの蛋白の細胞外部位をコードするcDNAをPCRで単離し、昆虫細胞発現系であるバキュロウイルスのトフンスファーベクターにサブクローニングし、そのC末端にさらにE-tag、His-tagを挿入した。作製した各種のコンストラクトを直鎖状にした後、昆虫細胞であるSF9細胞にトランスフェクトし、相同組み換えにより、DscのcDNAをもったリコンビナントバキュロウイルスを作製し、さらに同様のサイクルを4ー5回繰り返してウイルスを増幅した。最終的に、High-Five細胞を用いてリコンビナントバキュロウイルス蛋白を多量に産生させた。このHis-tagに結合するTalon columnにより培養上清からリコンビナント蛋白を精製した。抗E-tag抗体を用いた免疫ブロット法でリコンビナントバキュロウイルス蛋白が正しく産生されていることを確認した。このヒトDscバキュロウイルス蛋白を用いたELISA法を開発した。すなわち、これらの精製リコンビナント蛋白をELISAプレートにコーティングし、さらに、一次抗体として希釈患者血清と反応後、二次抗体としてperoxidase標識抗ヒトIgGないしIgA抗体と反応させ、発色後、ELISA readerを用いて吸光度を測定した。ELISA法にて陽性所見が得られた血清について、IgA抗体に関しては、Dsc1-3のcDNAトランスフェクション法を用いて、その存在をさらに確認した。ELISA法にて陽性所見が得られた血清について、IgG抗体に関しては、Dsc1-3のバキュロウイルス蛋白を結合させたTalon resinを用いて、Dsc1-3に特異的なIgGをaffinity精製する。その精製IgGを蛍光抗体法で検索し、その特異的染色パターンの有無を検索した。

以人Dsc1、Dsc2和Dsc3的全长cDNA为模板，通过PCR分离编码每种蛋白胞外部分的cDNA，亚克隆到杆状病毒Tofunsfer载体（一种昆虫细胞表达系统）和E-tag中和His-标签进一步插入C-末端。将构建的各种构建体线性化后，转染至SF9昆虫细胞中，通过同源重组产生含有Dsc cDNA的重组杆状病毒，并重复相同的循环4至5次，重复扩增病毒。最后，我们利用 High-5 细胞生产了大量的重组杆状病毒蛋白。使用与该 His 标签结合的 Talon 柱从培养物上清液中纯化重组蛋白。使用抗E-tag抗体通过免疫印迹证实重组杆状病毒蛋白的正确产生。我们使用这种人类 Dsc 杆状病毒蛋白开发了一种 ELISA 方法。即将这些纯化的重组蛋白包被在ELISA板上，然后与稀释的患者血清作为一抗反应，再与过氧化物酶标记的抗人IgG或IgA抗体作为二抗反应，显色后，使用 ELISA 读数器测量吸光度。对于通过ELISA法得到阳性结果的血清，通过Dsc1-3 cDNA转染法进一步确认了IgA抗体的存在。对于通过ELISA法获得阳性结果的血清的IgG抗体，使用与Dsc1-3杆状病毒蛋白结合的Talon树脂亲和纯化针对Dsc1-3的特异性IgG。使用荧光抗体法检查纯化的 IgG，以确定是否存在其特定的染色模式。