中枢神経系におけるミエリン形成機構解明に関する研究

阐明中枢神经系统髓磷脂形成机制的研究

• 批准号: 02J10545
• 负责人: 秋葉 陽介
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J10545/
• 关键词: ミエリン; ゼブラフィッシュ; プロモーター; P0; zebrafish; ミエリン形成; P0蛋白; 中枢神経系; オリゴデンドロサイト

ミエリンの形成過程をゼブラフィッシュの生体外から記録するために、オリゴデンドロサイトに特異的なP0蛋白のプロモーターを利用してGFPを発現させることで、オリゴデンドロサイトのみをラベル、これにより細胞の形態・ミエリン形成を観察することが可能になる。免疫染色等からP0蛋白はゼブラフィッシュのミエリン形成を開始する前のオリゴデンドロサイトの細胞体および細胞突起に豊富に発現し、ミエリン形成過程を追跡するためのマーカーとして有用であることを確認。さらにプロモーターコントロールのもとでGFPを発現させる目的でDNA constructの作成に着手。zebrafish BAC libraly screeningよりzebrafish P0 BAC CLONEを入手、制限酵素切断の後、self ligationしたサンプルより配列を解析。その結果exonIII,IV,V付近の構造は判明したが,それよりも上流のexon, intron構造に関しては解析が及ばなかった。既知のゼブラフィッシュP0蛋白のcDNAより5'側領域の配列をもとにプライマーを設定、zebrafish P0 BAC CLONEからプロモーター領域を含むと思われるサンプルをPCR法によりscreening、subcloningし、P0蛋白の上流に位置すると考えられる1〜6kbの数種のサンプルを得た。これらのサンプルをプロモーター領域を持たないGFPにhomologus recombinationによってcloningし、1〜4細胞期のゼブラフィッシュ胚にinjectし発現解析することでプロモーター領域を含むfragment,および領域の同定した。また発現解析時の発現部位の確認のためのコントロールとしてゼブラフィッシュP0蛋白のcDNAの全長をcloningすることを目的としてzebrafish cDNA libralyを作成した。

为了在斑马鱼体外记录髓磷脂形成过程，我们使用少突胶质细胞特异性P0蛋白启动子表达GFP，从而仅标记少突胶质细胞，从而改善细胞形态。 ・可以观察髓磷脂形成。免疫染色等研究证实，P0蛋白在斑马鱼髓鞘形成开始前在少突胶质细胞的细胞体和细胞突起中大量表达，可作为追踪髓鞘形成过程的标记物。此外，我们开始创建 DNA 构建体，以便在启动子控制下表达 GFP。通过斑马鱼BAC文库筛选获得斑马鱼P0 BAC CLONE，并对自连接样品进行酶切后进行序列分析。结果，明确了外显子III、IV和V周围的结构，但无法分析外显子和内含子上游的结构。根据已知斑马鱼P0蛋白的cDNA 5'区域的序列设置引物，从斑马鱼P0 BAC CLONE中筛选出被认为含有启动子区域的样品，利用PCR法进行亚克隆，得到引物。我们获得了多个 1 至 6 kb 的样本，这些样本被认为位于同一位置。通过同源重组将这些样本克隆到不具有启动子区域的GFP中，然后注射到1至4细胞阶段的斑马鱼胚胎中，并进行表达分析以鉴定含有启动子区域的片段和区域。我们还创建了斑马鱼cDNA文库，用于克隆斑马鱼P0蛋白的全长cDNA作为对照，以在表达分析时确认表达位点。

项目成果

YOSUKE AKIBA: "ADAMTS-9 Is Expressed in Mandibular Condyle and Growth Plate Cartilage"Journal of Dental Research Vol.83, special Issue A. 83巻. 1180 (2004)

YOSUKE AKIBA：“ADAMTS-9 在下颌骨髁和生长板软骨中表达”牙科研究杂志第 83 卷，特刊 A. 83. 1180 (2004)