光親和性ラベル化後修飾法を用いた糖質センサーの開発

利用光亲和标记后修饰方法开发碳水化合物传感器

• 批准号: 02J09239
• 负责人: 笠置 典之
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J09239/
• 关键词: タンパク質; 分子認識; 蛍光性バイオセンサー; カーボニックアンヒドラーゼ; アフィニティーラベル化後修飾; 糖質; バイオセンター; 光親和性ラベル化; 光親和性; コンカナバリンA; アルデヒド; 蛍光センサー

3次元的に折り畳まれた状態でのタンパク質は、複数のアミノ酸が反応性の官能基として表面に存在している。そのため、タンパク質表面の特定のアミノ酸残基を位置および官能基選択的に区別し、かつ、タンパク質同士の表面接触に打ち勝って特定のタンパク質表面を化学変換することは困難である。さらに、タンパク質が機能を発現する場は、従来の有機化学が苦手とする水中であるため、既存の有機化学的アプローチが通用しない場合も多い。よって、タンパク質を有機化学の対象として化学変換するには、タンパク質に適した新たな戦略が必要とされる。このような観点から、筆者は、ペプチド、タンパク質表面を標的とした新しい有機化学的な手法の開発を目指した検討を行った。カーボニックアンヒドラーゼ(hCA II)の阻害剤の分子認識とタンパク質表面での新しい有機化学反応を利用し、ワンポット連続反応によってhCA II表面に蛍光色素を高収率で導入できることを示した。タンパク質表面とのラベル化反応には、エポキシ基とイミダゾール環との特異的な求核反応を利用し、蛍光色素修飾反応には、ヒドラゾン/オキシム交換反応を用いた。これらの連続反応により、hCA II本来の機能を保持したまま、蛍光性バイオセンサーへと変換することに成功した。本手法は、システインを有するタンパク質にも適用可能であることが実証された。これによって、これまでに報告されてきた光アフィニティーラベル化後修飾法(P-PALM法)を拡張した新たな戦略を提案することに成功した。

在三维折叠蛋白质中，多个氨基酸作为反应性官能团存在于表面。因此，很难通过位置和官能团选择性地区分蛋白质表面上的特定氨基酸残基，并通过克服蛋白质之间的表面接触来对特定蛋白质的表面进行化学转化。此外，由于蛋白质在水中表达其功能，而传统的有机化学在水中较弱，因此现有的有机化学方法通常不起作用。因此，需要适合蛋白质的新策略来化学转化蛋白质作为有机化学的靶标。从这个角度出发，作者进行了一项研究，旨在开发一种针对肽和蛋白质表面的新有机化学方法。通过利用碳酸酐酶 (hCA II) 抑制剂的分子识别和蛋白质表面上的新有机化学反应，我们证明可以通过一锅连续反应将荧光染料高产率引入到 hCA II 表面。环氧基和咪唑环之间的特定亲核反应用于与蛋白质表面的标记反应，腙/肟交换反应用于荧光染料修饰反应。通过这些连续反应，我们成功地将 hCA II 转化为荧光生物传感器，同时保留其原始功能。事实证明，该方法也适用于含有半胱氨酸的蛋白质。结果，我们成功地提出了一种新策略，扩展了迄今为止已报道的光亲和标记后修饰方法（P-PALM方法）。

项目成果

Noriyuki Kasagi: "Photo-Responsive Property of Semi-Synthetic RNase A By Peptide Backbone Engineering"Biomolecular Chemistry. 290 (2003)

Noriyuki Kasagi：“通过肽主链工程实现半合成 RNase A 的光响应特性”生物分子化学。

笠置 典之: "ヘムタンパク質の超分子化学"化学工業. 6月. 449-452 (2002)

Noriyuki Kasagi：“血红素蛋白的超分子化学”Kagaku Kogyo 449-452 (2002)。