アルツハイマー病発症に関与するアポリポプロテインEの分子細胞生物学的研究

载脂蛋白E参与阿尔茨海默病发病的分子和细胞生物学研究

• 批准号: 02J04930
• 负责人: 大久保 信孝
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Ehime University (2003)Osaka University (2002)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J04930/
• 关键词: アポリポ蛋白E; アルツハイマー病; 神経細胞死; タウ; リン酸化; リーリン; アポリポプロテインE; リーラーマウス; Tauタンパク質; ノックアウトマウス; GSK3β; CDK5

研究の目的:アポリポ蛋白E(アポE)が神経細胞内タウ蛋白のリン酸化を調節していることを証明するとともに、神経細胞内タウ蛋白が高度にリン酸化されたモデルマウスを作製し、痴呆症治療薬・予防薬の開発に資することを目的とした。方法:アポE遺伝子の欠損マウス(ApoE^<-/->)をリーリン遺伝子欠損マウス(Reelin^<-/->;リーラーマウス)と掛け合わせ、F2世代にApoE^<-/->-Reelin^<-/->型マウス、ApoE^<+/->Reelin^<-/->型マウス、ApoE^<+/+>Reelin^<-/->型マウスを同腹仔として得た。同様にDab-1欠損マウス(Dab-1^<-/->;ヨタリマウス)と掛け合わせ、ApoE^<-/-> Dab-1^<-/->型マウス、ApoE^<+/-> Dab-1^<-/->型マウス、ApoE^<+/+> Dab-1^<-/->型マウスを得た。3週令における脳内リン酸化タウ蛋白量を、種々の抗リン酸化タウ蛋白抗体(表1)を用いたウエスタンブロッティング法や免疫組織化学法により定量した。またタウ蛋白リン酸化酵素GSK-3βやCDK-5の酵素活性、蛋白量をin vitro kinase assayやウエスタンブロッティング法で定量した。結果:予備実験として、我々はアポE欠損マウス脳におけるタウ蛋白のリン酸化度を測定したが、免疫組織化学的手法を用いてもウエスタンブロッティング法を用いても有意なリン酸化の亢進は認めなかった。そこで、タウ蛋白の高度リン酸化が知られているリーリン遺伝子欠損マウスおよびDab-1遺伝子欠損マウス(ヨタリマウス)をアポE欠損マウスと掛け合わせることにより、リン酸化タウ蛋白レベルをかさ上げし、生体内においてアポEがタウ蛋白のリン酸化に及ぼす影響を調べることとした。その結果、リーリン遺伝子欠損マウスとの掛け合わせではアポE遺伝子量が減るほどタウ蛋白の特定部位(タウリン酸化酵素の一つであるGSK-3βの認識部位)のリン酸化度が増大した。またGSK-3β活性および酵素量が増大した。一方、Dab-1遺伝子欠損マウスとの掛け合わせではタウ蛋白のリン酸化度はアポE遺伝子量に依存しなかった。考案:我々は世界に先駆けて、アポEがアポE受容体、Dab-1およびGSK-3βの活性化の抑制を通じてタウ蛋白のリン酸化を抑制していることを、動物モデルを用いて証明した。すなわちアポEはタウ蛋白のリン酸化を抑制することによって、神経細胞を防御していると考えられた。我々が作製したアポE/リーリン両遺伝子欠損マウス(ApoE^<-/->Reelin^<-/->)は、これまで報告されたモデルマウスの中でも脳内タウ蛋白のリン酸化度が最も高いモデルと考えられ、神経細胞死、アルツハイマー病、脳の老化のモデルマウスとして有望と考える

研究目的：证明载脂蛋白E（apoE）调节神经细胞中tau蛋白的磷酸化，并创建神经细胞中tau蛋白高度磷酸化的小鼠模型，旨在为治疗药物的开发做出贡献。以及该疾病的预防药物。方法：将ApoE基因缺陷小鼠（ApoE^<-/->）与Reelin基因缺陷小鼠（Reelin^<-/->；reeler小鼠）杂交，得到ApoE^<-/ ->-Reelin^<-/->型小鼠、ApoE^<+/->Reelin^</-/->型小鼠和ApoE^<+/+>Reelin^</-/->型小鼠作为同窝小鼠。知道了。同样，通过杂交 Dab-1 缺陷型小鼠（Dab-1^<-/->；摆动小鼠）、ApoE^<-/-> Dab-1^<-/-> 型小鼠、ApoE^<+/- >获得Dab-1^</-/->型小鼠和ApoE^<+/+>Dab-1^</-/->型小鼠。使用各种抗磷酸化 tau 抗体，通过蛋白质印迹和免疫组织化学对 3 周龄时大脑中磷酸化 tau 蛋白的量进行定量（表 1）。此外，使用体外激酶测定和蛋白质印迹法对 ​​tau 蛋白激酶 GSK-3β 和 CDK-5 的酶活性和蛋白水平进行定量。结果：作为初步实验，我们测量了 apoE 缺陷小鼠大脑中 tau 蛋白的磷酸化程度，但使用免疫组织化学或蛋白质印迹法均未观察到磷酸化的显着增加。因此，通过将已知tau蛋白高度磷酸化的Reelin基因缺陷小鼠和Dab-1基因缺陷小鼠（Yotari小鼠）与apoE缺陷小鼠杂交，我们增加了磷酸化tau蛋白的水平，我们决定进行研究apoE对tau蛋白磷酸化的影响。结果，当与Reelin基因缺陷小鼠杂交时，tau蛋白特定位点（tau磷酸化酶GSK-3β的识别位点）的磷酸化程度随着apoE基因数量的减少而增加。此外，GSK-3β活性和酶量增加。另一方面，当与Dab-1基因缺陷小鼠杂交时，tau蛋白的磷酸化程度并不依赖于apoE基因的量。想法：我们是世界上第一个使用动物模型证明 apoE 通过抑制 apoE 受体、Dab-1 和 GSK-3β 的激活来抑制 tau 蛋白磷酸化的人。换句话说，apoE被认为通过抑制tau蛋白的磷酸化来保护神经元。我们创建的apoE/Reelin基因缺陷小鼠（ApoE^<-/->Reelin^</-/->）是迄今为止报道的模型小鼠中脑tau蛋白磷酸化程度最高的小鼠，被认为是一种有前途的小鼠。神经元细胞死亡、阿尔茨海默病和大脑衰老的模型。

项目成果

Ohkubo N, Lee YD, Morishima A, Terashima T, Kikkawa S, Tohyama M, Sakanaka M, Tanaka J, Maeda N, Vitek MP, Mitsuda N.: "Apolipoprotein E and Reelin ligands modulate tau phosphorylation through an apolipoprotein E receptor/disabled-1/glycogen synthase kina

Ohkubo N、Lee YD、Morishima A、Terashima T、Kikkawa S、Tohyama M、Sakanaka M、Tanaka J、Maeda N、Vitek MP、Mitsuda N.：“载脂蛋白 E 和 Reelin 配体通过载脂蛋白 E 受体调节 tau 磷酸化/禁用

Ohkubo N, Lee YD, Morishima A, et al.: "Apolipoprotein E and Reelin ligands modulate tau phosphorylation through an apolipoprotein E receptor/disabled-1/glycogen synthase kinase-3beta cascade."FASEB Journal. 17・2. 295-297 (2003)

Ohkubo N、Lee YD、Morishima A 等人：“载脂蛋白 E 和 Reelin 配体通过载脂蛋白 E 受体/disabled-1/糖原合成酶激酶 3beta 级联调节 tau 磷酸化。”FASEB 杂志 17・2。 (2003)

Morishima A, Ohkubo N, Maeda N, Miki T, Mitsuda N: "NFκB regulates plasma apolipoprotein A-I and HDL-cholesterol through inhibition of PPARα"Journal of Biological Chemistry. 278・40. 38188-38193 (2003)

Morishima A、Ohkubo N、Maeda N、Miki T、Mitsuda N：“NFκB 通过抑制 PPARα 调节血浆载脂蛋白 A-I 和 HDL-胆固醇”《生物化学杂志》278・40 (2003)。