ヒトドーパミントランスポーターの多型の生理的意義と個体における機能の解析

人多巴胺转运蛋白多态性的生理意义及其在个体中的功能分析

基本信息

批准号：
02J03465
负责人：
福家聡
金额：
$ 2.24万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02J03465/
关键词：
dopamine transporter polymorphism VNTR hesr1 bHLH reporter assay SNP gene expression yeast one-hybrid system Hesr1 genome

项目摘要

前年度までに、DAT1遺伝子のVNTR多型は、反復回数によってレポーター遺伝子の発現に差があることと、この差が3'非翻訳領域依存的な遺伝子発現抑制の影響を受けることが解った。またVNTR多型近傍領域に作用する因子としてbHLH型の転写因子HESR1がDAT1遺伝子発現に関わることをルシフェラーゼレポーターアッセイにより示した。今年度においては、まずRNAiを用いたhesr1遺伝子特異的ノックダウンにより、SH-SY5Y細胞において見られたDAT1遺伝子3'非翻訳領域依存的な遺伝子発現抑が緩和されることを示した。また、HEK293細胞においてHESR1は内在性のDAT1遺伝子発現を抑制することを示した。HESR1によるDAT1遺伝子発現調節が直接的な結合によるものかどうかを検討するために、ゲルシフトアッセイを行ったところ、HESR1はDAT1遺伝子VNTR多型近傍領域に直接結合することが解った。加えて、NCBIデータベースを元に、ヒトhesr1遺伝子に存在し、DNA結合に重要なbHLHドメインのロイシンをメチオニンに置換するSNP候補C386Aに注目し、機能解析を行ったところC386A変異体はDAT1遺伝子発現抑制活性を失うことをレポーターアッセイにより示した。この活性の違いはDNA結合能を失ったことによるものであることをゲルシフトアッセイにより示し、これはホモ二量体形成能を減少させているためであることをYeast two-hybridにより示した。以上のことからヒトhesr1遺伝子SNP候補C386AはDAT1遺伝子が関わる多因子性表現型のリスクファクターである可能性を示唆した。

到上一年，发现Dat1基因中的VNTR多态性在报告基因的表达方面有所不同，具体取决于重复的数量，并且这种差异受3'未翻译区域依赖性基因表达抑制的影响。此外，荧光素酶报告基因测定法表明，BHLH-type转录因子HESR1参与DAT1基因表达，这是作用于VNTR多态性区域的因素。在这个财政年度，我们首先表明使用RNAi的HESR1基因特异性敲低减轻了SH-SY5Y细胞中看到的3'未翻译区域依赖性基因表达抑制。此外，HESR1抑制HEK293细胞中的内源性DAT1基因表达。为了研究hesr1的调节dat1基因表达是否是由于直接结合引起的，进行了凝胶转移测定法，发现HESR1直接与dat1基因VNTR多态性的区域结合。此外，基于NCBI数据库，我们重点关注SNP候选C386A，该C386A取代了BHLH结构域中的亮氨酸，这对于DNA结合很重要，蛋氨酸与人hesr1基因中存在，并且对DNA中很重要，并且对DNA结合至关重要，并且表现出了c386a Mutants data Date noters dataTe nator datate gene conters contress contress contress centers nation datata gene。由于DNA结合能力的丧失，通过凝胶转移测定法显示了这种活性的差异，并且通过酵母两杂种，这是由于同型二聚体形成能力降低所致。以上表明人hesr1基因SNP候选C386A可能是涉及dat1基因的多因素表型的危险因素。