クライオ電子顕微鏡法によるセルロース合成酵素の立体構造解析

使用冷冻电子显微镜对纤维素合酶进行三维结构分析

基本信息

批准号：
02J01006
负责人：
今井友也
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

1.本研究課題の目的は、セルロース合成酵素の機能をその構造から明らかにすることにある。電子顕微鏡による単粒子構造解析を目指して、酢酸菌からセルロース合成酵素の単離精製実験を既報に従い行ってきたが、成功していない。そこで異種発現系の構築を目指してセルロース合成酵素オペロンのクローニングを行うべく、プライマー設計まで行った。また合成酵素の単離を生化学的に追跡する手段がないため、ポリクロ抗体の作製を外注にて行っている。セルロース合成酵素(BcsA遺伝子産物)そのものに加えて、同一オペロンに存在するBcsC遺伝子産物の追跡を開始すべく、これに対する抗体も作製依頼中である。2.セルロースも含めて多糖分子の合成酵素を考える際に、糖転移反応に関する酵素学的な視点は大きく取り上げられてきたが、ミクロフィブリルなどの高次構造を形成する機構の具体的な認識が乏しいという問題点を、多糖の合成例の比較から指摘した(第6回理研シンポジウム「高分子結晶の構造と機能」において発表)。3.二次元結晶化によるタンパク構造解析は、膜タンパクの構造解析として非常に有用であることが示されつつある。しかしX線結晶解析用の三次元結晶と対照的に、二次元結晶作製の方法論は確立されたものではない。将来的にセルロース合成酵素の高分解能解析のためには必須であろう二次元結晶解析を見据え、あるバクテリア由来の膜タンパク質を用いて二次元結晶化の方法論の確立を目指して実験を開始した。現在まで、脂質二重層内に再構成された構造物をコンスタントに得られるようになったが、まだ結晶性が弱く解析に値するものは得られていない。それでも精製・結晶化の間に静電作用を抑える戦略が重要であることが分かりつつある。

1. 本研究项目的目的是从结构上阐明纤维素合酶的功能。我们一直在对醋酸菌的纤维素合酶进行分离和纯化实验，以便使用电子显微镜分析单个颗粒的结构，但尚未成功。因此，为了克隆纤维素合酶操纵子以构建异源表达系统，我们甚至设计了引物。此外，由于没有方法对合成酶的分离进行生化追踪，多色抗体的生产被外包。除了纤维素合酶（BcsA 基因产物）本身之外，我们还要求生产针对同一操纵子中存在的 BcsC 基因产物的抗体，以便开始对其进行追踪。 2.当考虑合成包括纤维素在内的多糖分子的酶时，转糖基反应的酶学视角已被广泛讨论，但对形成微纤维等高级结构的机制的具体理解仍不清楚。多糖合成的实例（在第六届理化学研究所“聚合物晶体的结构和功能”研讨会上发表）。 3. 二维结晶的蛋白质结构分析被证明对于膜蛋白的结构分析非常有用。然而，与 X 射线晶体学的三维晶体相比，生产二维晶体的方法尚未建立。预计二维晶体分析对于未来纤维素合酶的高分辨率分析至关重要，我们开始了实验，旨在使用源自某种细菌的膜蛋白建立二维结晶方法。迄今为止，不断获得脂双层内重建的结构已成为可能，但结晶度仍然较弱，尚未获得值得分析的结构。然而，事实证明，在纯化和结晶过程中抑制静电效应的策略很重要。