角膜透明性に関するクロライドチャネルの役割の研究

研究氯离子通道对角膜透明度的作用

• 批准号: 02F00813
• 负责人: 木下 茂
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Kyoto Prefectural University of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-02F00813/
• 关键词: CLCA2; インテグリンβ4; ラミニン5; TritonX-100; ケラケノサイト; クロライドチャネル; 角膜; 細胞増殖

研究の成果としては、まず世界ではじめてCLCA2の抗体作成に成功した。またこの抗体の特異性、反応性についてもCLCA2遺伝子をHela細胞に遺伝子導入しこれに対して免疫染色を行い、タグエピトープとの共発現を見ることで証明した。得られた抗体を角膜、結膜、その他の上皮系組織について免疫染色してその発現、局在を調べ、結果としてCLCA2遺伝子はケラチノサイト系上皮細胞の特に基底細胞の基底サイドの細胞膜に極めて特異的に発現していることが判明した。このことは世界に先駆けてわれわれが発見したものである。このことはさらにRT-PCRおよび定量RT-PCRによって確認できた。さらなる微小局在について免疫電顕でしらべたところ、CLCA2はヘミデスモゾームに近接して発現していた。またヘミデスモゾーム構成タンパクであるインテグリンβ4、ラミニン5、コラーゲン7との関連を免疫染色、免疫電顕で調べたところ、両者の間には際立った一致が見られ、機能的な関連が示唆された。さらにCLCA2が単一膜タンパクでなく、他のタンパクと複合体を形成しているかを調べるために、界面活性剤であるTritonX100処理後のCLCA2の染色性を免疫染色で調べた。コントロールのInsulin receptorは単独で存在する膜レセプターであるが、これはTritonX100処理によって染色されなくなった。しかしCLCA2はTritonX100処理後にも染色がほとんど変化せず、他のタンパクおそらくヘミデスモゾーム関連タンパクを介して細胞骨格と複合体を形成しTritonX100にて抽出されない状態にあるものと推定された。今後は角膜上皮細胞のセルライン(hTERTで不死化したもの)にCLCA2遺伝子のsiRNA発現ベクターを導入し、stable cellを得てこれの表現系解析を行うつもりである。

我们的研究结果是，我们是世界上第一个成功制造 CLCA2 抗体的人。我们还通过将 CLCA2 基因引入 Hela 细胞，对细胞进行免疫染色，并观察与标签表位的共表达，证明了该抗体的特异性和反应性。使用获得的抗体对角膜、结膜和其他上皮组织进行免疫染色以研究其表达和定位，结果发现CLCA2基因对角质形成细胞上皮细胞基底侧的细胞膜具有高度特异性。发现基底细胞正在发生这种情况。我们是世界上第一个发现这一点的人。 RT-PCR和定量RT-PCR进一步证实了这一点。使用免疫电子显微镜进行的进一步微定位显示，CLCA2 在半桥粒附近表达。此外，当我们使用免疫染色和免疫电子显微镜检查与半桥粒组成蛋白整合素 β4、层粘连蛋白 5 和胶原蛋白 7 的关系时，我们发现两者之间存在惊人的一致性，表明存在功能关系。此外，为了研究CLCA2是否不是单一的膜蛋白而是与其他蛋白形成复合物，通过免疫染色检查了用表面活性剂TritonX100处理后的CLCA2的染色特性。对照胰岛素受体是单独存在的膜受体，但 TritonX100 处理后不再被染色。然而，即使在 TritonX100 处理后，CLCA2 的染色也几乎保持不变，这表明它通过其他蛋白质（可能是半桥粒相关蛋白质）与细胞骨架形成复合物，并且未被 TritonX100 提取。未来，我们计划将CLCA2基因的siRNA表达载体导入角膜上皮细胞系（hTERT永生化），获得稳定细胞，并对该细胞系进行表型分析。