担子菌の子実体形成に関わる酵素とその遺伝子の発現と制御

担子菌子实体形成相关酶及其基因的表达与调控

基本信息

批准号：
02F00515
负责人：
鮫島正浩
金额：
$ 1.47万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

担子菌の培養系としては、木粉を用いた固体培養が一般的であるが、木粉培養系は、担子菌の酵素学的実験を行う際に、困難な点が多い。このような問題を解決するために、以前の研究により、グルコースを炭素源としてオオウズラタケの子実体形成の液体培養系を確立した。より自然界に近い培養系、すなわちセルロースやセロビオースのような単糖以外の炭素源を含む培地において本菌の子実体形成を試した結果、特に、0.2%のセロビオースを含んでいるセルロース固体培養系においては、グルコースのみを炭素源にした液体培養系より早い菌体生育が観察され、また、子実体においても約1.5倍以上早い培養期間で形成されることが確認された。本研究において確立したセルロース固体培養系を用いて、菌体内に糖が吸収されるメカニズムを解明するために、菌体外酵素の変動を調べ、菌体の生育と伴って酵素の発現を調べた。オオウズラタケを1.5%の固体セルロースを含むWood培地に接種し、26.5℃で静置培養した後、培養14日日の菌体外液を限外ろ過して粗酵素液を得た。得られた粗酵素液をSDS-PAGEに供した結果、30kDaおよび37kDa付近に2つの主要なバンドが確認された。同様の実験を1.5%の固体セルロースに0.15%のセロビオースを添加した培養系について行ったところ、生育が著しく向上され、さらに上述の二つのタンパク質に加えて、セロビオースの添加によって特異的に誘導される70kDaのタンパク質が存在することが明らかになった。このタンパク質をカラムクロマトグラフィーによって精製し、様々なセルラーゼ活性を測定したが、活性を検出することはできなかった。したがって、セルラーゼ以外のタンパク質がセロビオースによって誘導されることが明らかとなった。また、30kDa及び37kDaのタンパク質は、色素結合型ヒドロキシエチルセルロースを分解したことから、エンドグルカナーゼであると考えられた。現在、これらの主要タンパク質の同定を行うために精製を行い、諸性質について検討中である。

作为担子菌的培养体系，一般采用木粉固体培养，但木粉培养体系在对担子菌进行酶促实验时存在很多困难。为了解决这些问题，前期研究建立了以葡萄糖为碳源的日本眼螟子实体形成的液体培养体系。我们在更接近自然的培养系统（即含有纤维素和纤维二糖等单糖以外的碳源的培养基）中测试了该真菌的子实体形成，结果发现，特别是在纤维素固体培养系统中观察到，与仅使用葡萄糖作为碳源的液体培养系统相比，细菌细胞的生长速度更快，并且还证实在培养期间子实体的形成速度快约1.5倍。利用本研究中建立的纤维素固体培养系统，为了阐明细菌细胞吸收糖的机制，我们研究了细胞外酶的变化并检查了细胞生长时酶的表达。将变异链球菌接种到含1.5%固体纤维素的Wood's培养基中，26.5℃静态培养，培养14天后，将细胞外液超滤，得到粗酶液。将得到的粗酶液进行SDS-PAGE，结果在30kDa和37kDa附近确认了两条主要条带。当在1.5%固体纤维素中添加0.15%纤维二糖的培养系统上进行类似的实验时，生长得到显着改善，并且除了上述两种蛋白质之外，还通过添加纤维二糖特异性地诱导生长。揭示了 70kDa 蛋白质的存在。通过柱层析纯化该蛋白质并测量各种纤维素酶活性，但没有检测到活性。因此，表明纤维素酶以外的蛋白质是由纤维二糖诱导的。此外，30kDa 和 37kDa 蛋白质被认为是内切葡聚糖酶，因为它们降解染料结合的羟乙基纤维素。目前，我们正在进行纯化以鉴定这些主要蛋白质并检查它们的特性。