超高分解能X線結晶構造解析によるファミリー18キチナーゼの反応機構の解明

通过超高分辨率X射线晶体学阐明18族几丁质酶的反应机制

基本信息

批准号：
13780528
负责人：
野中孝昌
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Nagaoka University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

Bacillus circulans WL-12由来キチナーゼAl及び同株由来キチナーゼDは共にキチンを2糖単位で加水分解するマルチドメイン構造を持った糖鎖加水分解酵素である。キチナーゼはアミノ酸配列の相同性に基づいて分類されたファミリーの中で、ファミリー18及び19のどちらかに全てが分類されており、キチナーゼAlとキチナーゼDはどちらもファミリー18に属している。キチナーゼAl及びDに関しては、どちらも触媒活性ドメイン(以下、CatD)のみにしたフラグメント酵素の結晶化に成功してしる。キチナーゼAl及びDのCatD結晶のX線回折強度データの収集は、高エネルギー加速器研究機構および高輝度光科学研究センターで行った。キチナーゼAlの異なった結晶化条件によって得られた結晶の構造精密化からは、非対称単位中の分子数が異なる分子モデルも構築した。さらに、基質複合体及び阻害剤複合体に関しても高分解能のX線回折強度データが得られたので、結晶中のタンパク質以外のヘテロ分子の構造を明瞭に同定することができた。ファミリー18に属する酵素の反応を特異的に阻害するアロサミジンとデメチルアロサミジンを用いて複合体結晶を作製した。これらのアロサミジン類に対しては、分子軌道法計算を行う事で周囲のアミノ酸や水分子の影響を考慮した理想構造を作製した。理論的に不自然な結合長、結合角そして原子間距離を修正していく事で構造をさらに精密なものとした。構造精密化の終了した野生型キチナーゼAlCatDの結晶構造については、プロテインデータバンク(PDB)への登録を行った。キチナーゼDに関しては、基質複合体結晶を作製することができなかったので、現在ある蛋白質単独及び阻害剤複合体の結晶構造の精密化を行った。阻害剤であるアロサミジン類の結合によって生じた周囲の主鎖の構造変化や乱れの様子が詳しく分かった。

源自环状芽孢杆菌WL-12的几丁质酶A1和源自同一菌株的几丁质酶D都是具有多结构域结构的糖链水解酶，其将几丁质水解成二糖单元。在根据氨基酸序列同源性分类的家族中，所有几丁质酶都被分为家族18或家族19，并且几丁质酶A1和几丁质酶D都属于家族18。对于几丁质酶A1和D，仅含有催化活性结构域的片段酶(下文中称为CatD)成功结晶。几丁质酶Al和D的CatD晶体的X射线衍射强度数据是在高能加速器研究组织和高亮度光科学研究中心收集的。通过细化不同结晶条件下获得的几丁质酶Al晶体的结构，我们还构建了不对称单元中不同分子数的分子模型。此外，由于获得了底物复合物和抑制剂复合物的高分辨率X射线衍射强度数据，因此可以清楚地识别晶体中除蛋白质以外的杂分子的结构。我们使用阿洛脒和去甲基阿洛脒创建了一种复杂的晶体，可特异性抑制属于家族 18 的酶的反应。对于这些异糖脒，我们通过进行分子轨道计算创建了一个理想的结构，同时考虑了周围氨基酸和水分子的影响。通过修正理论上不自然的键长、键角和原子间距离，进一步细化结构。野生型几丁质酶AlCatD的晶体结构经过精修，已在蛋白质数据库（PDB）中注册。关于几丁质酶D，由于不可能制备底物复合物晶体，因此我们改进了单独的蛋白质和抑制剂复合物的现有晶体结构。详细阐明了别洛脒抑制剂结合引起的周围主链的结构变化和紊乱。