時間分解振動分光法による蛋白質高次構造変化の機能に果す役割の解明

使用时间分辨振动光谱阐明蛋白质构象变化在功能中的作用

• 批准号: 13308039
• 负责人: 北川 禎三
• 金额: $ 16.81万
• 依托单位: Okazaki National Research Institutes
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13308039/
• 关键词: 振動分光; 時間分解共鳴ラマン; 共鳴ラマン; 赤外吸収; 蛋白質ダイナミクス; 蛋白質高次構造

基質の脱着に伴う蛋白質高次構造の超高速ダイナミクスを調べるために、本研究では蛋白にミオグロビン(Mb)を、リガンドに一酸化炭素(CO)を用いた。一酸化炭素結合形ミオグロビン(MbCO)のCOは光で解離する。すなわち、MbCOのFe-CO結合は可視レーザー光照射により300フェムト秒以内に切れる。COは蛋白外に出ていき、蛋白はdeoxyMbの平衡構造に向かって変化していくが、その過程をピコ秒の時間分解共鳴ラマン分光法で調べた。主光源は1.5ps幅、82MHz繰り返し、平均出力0.7WのTi : sapphireレーザーで、それをNd : YLFレーザーの倍波(527nm)で増幅し、1kHz繰り返しのパルス列にしてから2系列に分け、各々の波長に変換した。光解離にはOPG法で変換した540nmのパルスを用い、ラマン散乱励起光としてはメタンの誘導ラマン散乱で得た442nmのパルスを用いた。両パルスの時間相関幅は2.3psで遅延時間のゼロは0.2psの精度で決まっている。この測定系は国際的にもトップレベルで、同レベルのデータをとれるグループは国際的にも無いと云える光解離1ps後のスペクトルではFc-His伸縮(ν_<Fe-His>)は222Cm^<-1>に、ヘムの面外振動(γ_7)が300cm^<-1>に、側鎖C_βC_cC_d変角振動[δ(C_βC_cC_d)]が369cm^<-1>に観測された。ν_<Fe-His>及びγ_7バンドの面積強度を遅滞時間に対してフロットすると、γ_7は速い立ち上がりの後、一定強度を示したが、ν_<Fe-His>はその後20ps迄じわじわと強度増加を示した。解析の結果、これはMbCO形ではヘム面内に位置していた鉄イオンが、deoxy形でヘム面より0.3ÅだけHis側にずれる構造変化を反映している事がわかった。その変化の80%は非常に速いが残り20%が1〜20psで起こる。一方ν_<Fe-His>振動数は、時定数106±14psで低波数シフトしたが、ポルフィリン環のγ_7やδ(C_βC_cC_d)バンドはその様なシフトを示さなかった。また蛋白のない鉄ポルフィリンイミダゾール錯体のCO光解離でも、ν_<Fe-lm>はν_<Fe-His>.バンドと同じように強度の時間変化を示したが、振動数変化は示さなかった。したがってν_<Fe-His>の振動数の時間変化は、蛋白質の3次構造の時間変化を反映しているものと思われる。

为了检查与底物脱离相关的高质量蛋白质结构的超高速度动力学，本研究使用了蛋白质和一氧化碳（CO）作为配体的Mioglobin（MB）。二氧化碳结合二氧化碳（MBCO）的CO与光分解。也就是说，通过可见的激光照射，MBCO Fe-CO结合在300秒内切成300秒。 cos脱离蛋白质，蛋白质向脱氧符号的平衡结构变化，但是通过时间分解共振拉曼分裂方法的pico秒进行了检查。主要的光源为1.5PS宽度，重复82MHz，平均输出为0.7W Ti：Sapphire Laser，由ND：YLF激光双波（527nm）放大，分为2 KHz脉冲柱，然后分为两个系列。转换为波长。对于光解剖，使用了通过OPG方法转换的540nm脉冲，并将通过拉曼散射拉曼散射获得的442 nm脉冲用作拉曼散射拉曼散射。两个脉冲的时间相关宽度为2.3ps，零延迟时间由0.2PS的精度确定。该测量系统在国际上是最高级别，并且在<-1>中没有相同的数据。观察到369cm^<-1>的变化角振动[δ（C_βC_CC_D）]。当ν_<fe-his>和γ_7带的面积强度在延迟时间上旋转时，γ_7在快速上升后显示出一定的强度，但是ν_<e-his>逐渐增加到20PS。分析的结果是，已经发现这是位于下摆表面的MBCO型的结构变化，但一种结构变化仅从脱氧形状的下摆表面移动0.3Å。 80％的变化非常快，但剩余的20％发生在1到20PS。另一方面，ν_<fe-his>频率在106±14ps时为低波动，但是卟啉环γ_7或δ（C_βCCC_D）频带没有显示出如此偏移。即使在没有蛋白质的铁卟啉唑配合物的CO光溶液中，ν_<e-e-lm>也显示出强度的变化，如ν_<fe-his>。因此，ν_<fe-his>振动的时间变化可能反映了蛋白质的三级结构的时间变化。

项目成果

Y Mizutani, T Kitagawa: "Vibrational Energy Relaxation of Metalloporphyrins in a Condensed Phase Probed by Time-Resolved Resonance Raman Spectroscopy"Bulletin of Chemical Society of Japan. 75. 1-17 (2002)

Y Mizutani、T Kitakawa：“通过时间分辨共振拉曼光谱探测凝聚相中金属卟啉的振动能量弛豫”日本化学会会刊。

N.Haruta, T.Kitagawa: "Time-resolved UV Resonance Raman Investigation of Protein Folding : Characterization of Kinetic and Equilibrium Intermediates of Apomyoglobin"Biochemistry. 41(印刷中). (2002)

N.Haruta、T.Kitakawa：“蛋白质折叠的时间分辨紫外共振拉曼研究：脱肌红蛋白的动力学和平衡中间体的表征”生物化学 41（出版中）。

北川 禎三 他: "生物と金属:金属イオンの生体内で働く仕組み"クバプロ. 207 (2001)

Teizo Kitakawa 等人：“生物学和金属：金属离子如何在生物体中发挥作用”KubaPro 207 (2001)。

S.G.Kruglik, P.Mojzes, Y.Mizutani, T.Kitagawa, P-Y.Turpin: "Time-resolved Resonance Raman Study of the Exciplex Formed Between Excited CuPorphyrin and DNA"Journal of Physical Chemistry. 105. 5018-5031 (2001)

S.G.Kruglik、P.Mojzes、Y.Mizutani、T.Kitakawa、P-Y.Turpin：“激发铜卟啉和 DNA 之间形成的激基复合物的时间分辨共振拉曼研究”物理化学杂志。

N.Haruta, M.Aki, S.Ozaki, Y.Watanab, T.Kitagawa: "Protein Conformation Change of Myoglobin upon Ligand Binding Probed by Ultraviolet Resonance Raman Spectroscopy"Biochemistry. 40. 6956-6963 (2001)

N.Haruta、M.Aki、S.Ozaki、Y.Watanab、T.Kitakawa：“通过紫外共振拉曼光谱探测配体结合时肌红蛋白的蛋白质构象变化”生物化学。