ダイニン外腕の機能的再構成

动力蛋白侧臂的功能重组

基本信息

批准号：
63580203
负责人：
神谷律
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-63580203/
关键词：
鞭毛繊毛ダイニン蛋白質運動性クラミドモナス

项目摘要

鞭毛運動の原動力を発生しているのはダイニン内腕と外腕という2種の蛋白質複合体である。我々はさきに外腕を完全に欠失しているクラミドモナス変異株を単離し、それが野生株の約1/3の運動性を有することを明らかにした。また、この変異株の鞭毛を除膜してそこに野生株鞭毛の粗抽出液を添加すると、外腕が正規の位置に結合するばかりでなく、APT存在下で運動性が野生株のレベルまで回復することを示した。これはダイニン外腕を可逆的に抽出・再結合できることを意味しており、ダイニン外腕の機能を研究する上で強力な手段となると考えられる。しかし、上記の実験は鞭毛粗抽出液を用いたものであり、運動性の回復が外腕の再結合だけによっているのか否かは未確定であった。そこで、本研究では純化した標品を用いて外腕欠失軸糸への外腕の再結合と機能の回復が起こる実験系を確立することを第一目標にした。またこの生物のダイニン外腕は抽出条件によっては2つの成分に解離するが、その2成分から機能的に正常な外腕を再構成する試みを行った。まず、野生株鞭毛の高塩溶液による粗抽出液を本補助金で購入したスイング形ローターを使い、ショ糖密度勾配遠心法によって分画した。その結果、Mg存在下で抽出したものは外腕が2つの成分に解離せず23Sの沈降定数を持つが、MG非存在下で抽出したものは18Sと12Sの2成分に解離することが分かった。23S標品を濃縮してから除膜した外腕欠失株に添加し、ATP存在下での運動性を検定したところ、鞭毛打頻度の上昇が確認された。すなわち純化したダイニン外腕標品を機能的に軸糸に結合させるという第一目標は達成されたことになる。18Sと12Sの2成分から外腕を再構成する試みはまだ成功していないが、23S標品での成功によって実験条件に関する様々な知見が得られたので、それを活かしながらさらに実験を続ける予定である。

两种蛋白质复合物，即动力蛋白的内臂和外臂，产生鞭毛运动的驱动力。我们之前分离出一种完全缺乏外臂的衣藻突变株，发现它的运动力约为野生株的三分之一。此外，当去除该突变株的鞭毛并添加野生型鞭毛的粗提取物时，不仅外臂附着在正常位置，而且运动性也达到野生型株的水平在 APT 存在的情况下显示恢复。这意味着动力蛋白外臂可以被可逆地提取和重组，被认为是研究动力蛋白外臂功能的有力工具。然而，上述实验使用了鞭毛的粗提物，尚不清楚运动性的恢复是否仅仅是由于外臂的重新附着。因此，本研究的主要目标是建立一个实验系统，在该系统中，使用纯化的制剂可以将侧臂重新附着到侧臂删除的轴丝上并恢复功能。此外，根据提取条件，该生物体的动力蛋白外臂解离成两个组件，但我们试图从这两个组件重建功能正常的外臂。首先，使用本次资助购买的摆动型转子，通过蔗糖密度梯度离心从高盐溶液中分离野生型鞭毛的粗提物。结果发现，在存在 Mg 的情况下提取的样品的外臂不解离成两个组分，并且沉降常数为 23S，但是在不存在 MG 的情况下提取的样品解离成两个组分，即 18S和12S。将23S制剂浓缩，添加到去膜的外臂缺失株中，测定ATP存在下的运动性，结果确认鞭毛的跳动频率增加。换句话说，将纯化的动力蛋白外臂制剂与轴丝功能性结合的第一个目标已经实现。用 18S 和 12S 两个部件重建外臂的尝试尚未成功，但 23S 标本的成功为我们提供了有关实验条件的各种知识，我们计划在进一步的实验中继续使用这些知识。这是。