RNA構造を標的とした抗ウイルス性ペプチドの遺伝的スクリーニング

针对 RNA 结构的抗病毒肽的基因筛查

基本信息

批准号：
13226031
负责人：
原田和雄
金额：
--
依托单位：
Tokyo Gakugei University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

HIV RNAの二量体化は、まず、dimer initiation site (DIS)と呼ばれるステム・ループ構造のループの部分を通して二量化する"kissing hairpin"構造を経て、より安定な"stable dimer"を形成することにより起こる。本研究では、HIV二量化の阻害を目的として、DIS、あるいは、"kissing hairpin"に結合するペプチドのコンビナトリアル・ライブラリーからの細胞内検出を試みた。本研究期間における研究成果は次の通りである:(1)ポリアルギニン(15残基)にコドン単位で変異を導入した新規RNA結合ポリペプチド・ライブラリーを作製し、HIV RREを標的としたテストを行った。これまでに同定されたRRE結合ペプチドよりも高い細胞内活性を持つペプチドを多数同定できたことから、新しいライブラリーの有効性を示した。(2)DISおよび"kissing hairpin"構造を標的としたスクリーニングを行い、第3次スクリーニングを完了した段階で、数多くの陽性クローンが得られた。現在、これらのクローンの中から、DIS、あるいは、"kissing hairpin"に特異的に結合するクローンの同定を行っている。(3)ペプチドによる"kissing dimer"から"stable dimer"へ移行の阻害が可能であるか検討するため、DISのステム領域にHIV RRE、あるいは、BIV TARのペプチド結合ドメインを挿入したキメラRNA分子を作製した。いずれのキメラRNA分子も野生型DISと同様に"kissing dimer"から"stable dimer"へ移行することをゲル電気泳動により確認した。そこで、現在はこの過程におけるペプチドの影響について検討している。本研究はHIV複製の制御の新しいアプローチであるばかりでなく、HIV RNAの二量化のメカニズムの解明、および、RNA-ポリペプチド相互作用の理解につながるものと期待される。

HIV RNA的二聚化首先通过“接吻发夹”结构发生，其中二聚化通过称为二聚体起始位点（DIS）的茎环结构的环部分发生，然后形成更稳定的“稳定二聚体”。由于在这项研究中，我们尝试在细胞内检测组合文库中与 DIS 或“接吻发夹”结合的肽，目的是抑制 HIV 二聚化。本研究期间的研究成果如下： (1)我们创建了一个新的RNA结合多肽文库，其中每个密码子都引入了聚精氨酸（15个残基）的突变，并针对HIV RRE进行了测试。我们能够鉴定出许多比迄今为止鉴定的 RRE 结合肽具有更高细胞内活性的肽，证明了新文库的有效性。 (2)针对DIS和“接吻发夹”结构进行筛选，三级筛选后获得大量阳性克隆。我们目前正在从这些克隆中鉴定出与 DIS 或“接吻发夹”特异性结合的克隆。 (3) 为了研究是否有可能通过肽来抑制从“接吻二聚体”到“稳定二聚体”的转变，我们创建了嵌合RNA分子，其中HIV RRE或BIV TAR的肽结合结构域被插入到茎区DIS 创建的。通过凝胶电泳证实，与野生型DIS类似，所有嵌合RNA分子都从“接吻二聚体”转变为“稳定二聚体”。因此，我们目前正在研究肽对此过程的影响。这项研究不仅有望提供一种控制HIV复制的新方法，还将有助于阐明HIV RNA二聚化机制并理解RNA-多肽相互作用。