偏性嫌気性細菌由来のリジン脱炭酸酵素の高次構造及び活性発現調節機構の解明

专性厌氧菌赖氨酸脱羧酶的高级结构和活性调节机制的阐明

基本信息

批准号：
01J08017
负责人：
高塚由美子
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

グラム陰性の偏性嫌気性細菌Selenomonas ruminantiumのべプチドグリカンに共有詰合したポリアミンの一種、カダベリンは、細胞分裂に必須の構成成分である。本菌のカダベリンを合成するリジン脱炭酸酵素(LDC)はオルニチンも認識し、一次構造はオルニチンに特異的な真核生物のオルニチン脱炭酸酵素(ODC)と高い相同性を持つ。一方で、本酵素は生育の定常期初期に急激に分解される厳密な発現親節を受けている。本研究は、本酵素の構造と基質認識機構との相関の分子レベルでの解明、および分解制御機構の解明を目的にしており、今年度までに以下の成果を得た。1.本酵素と真核生物ODCとの比較から、基質認識に関与すると推定した活性中心周辺の5アミノ酸残基に変異を導入し、オルニチンに対する特異性が70倍に高まったLDC変異酵素の作製に成功した。現在、大腸菌で大量発現させた組換え体LDCを用いて結晶化のスクリーニングを続行中である。2.本菌の細胞質画分を用いた本酵素のin vitro分解活性測定系を確立し、LDCの分解にATP要求性プロテアーゼが関与すること、本プロテアーゼは活性にMgイオンおよびジチオスレイトールを要求し、セリンプロテアーゼ阻害剤PMSFにより阻害を受けることを解明した。3.本菌の細胞質画分中にLDCと親和性を持つ22kDaおよび25kDaのタンパク質を見出し、このうち22-kDaタンパク質(P22)がLDCの分解を促進する分解促進因子であること、また遺伝子解析からグラム陽性菌のリボソームタンパク質L10と高い相同性を有すること、プトレシンにより誘導を受けLDCと、ほぼ同時期に分解消失すること、菌体内存在量はLDCの1/10-1/2であることを解明した。LDCに対するP22の解離定数は8.5μMであった。現在、動物細胞ODCの分解制御因子であるアンチザイムとの関連性を検討しながら、P22とLDC分解制御機構について解析を進めている。

尸胺是一种共价包装在革兰氏阴性专性厌氧细菌反刍硒单胞菌的肽聚糖中的多胺，是细胞分裂的重要成分。该细菌中合成尸胺的赖氨酸脱羧酶（LDC）也能识别鸟氨酸，其一级结构与特异于鸟氨酸的真核鸟氨酸脱羧酶（ODC）高度同源。另一方面，该酶受到严格的表达调节，在稳定期开始时它会迅速降解。本研究的目的是在分子水平上阐明该酶的结构与其底物识别机制之间的关系，并阐明其降解控制机制。截至今年，我们已获得以下成果。 1. 通过将该酶与真核ODC进行比较，将突变引入到活性中心周围的5个氨基酸残基（推测这些氨基酸残基参与底物识别），从而创建了一种LDC突变酶，其对鸟氨酸的特异性提高了70倍成功了。我们目前正在继续使用在大肠杆菌中大量表达的重组 LDC 进行结晶筛选。 2. 我们利用该细菌的细胞质部分建立了该酶的体外分解活性测量系统，并证明了LDC的分解涉及一种需要ATP的蛋白酶，并且该蛋白酶需要Mg离子和二硫苏糖醇来发挥其活性发现该蛋白被丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF抑制。 3.我们在该细菌的胞浆部分中发现了与LDC有亲和力的22kDa和25kDa蛋白，并发现22-kDa蛋白（P22）是促进LDC降解的降解促进因子，以及遗传分析。与革兰氏阳性菌核糖体蛋白L10具有高度同源性，受腐胺诱导，与LDC大约同时降解消失，在细菌中的存在量为LDC的1/10-1/2得到澄清。 LDC 的 P22 解离常数为 8.5 μM。目前，我们正在分析控制P22和LDC降解的机制，同时研究与抗酶的关系，抗酶是控制动物细胞中ODC降解的因素。