アクチン細胞骨格を制御するWAVEの機能解析

控制肌动蛋白细胞骨架的 WAVE 功能分析

• 批准号: 01J06201
• 负责人: 佐々木 信成
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J06201/
• 关键词: アクチン; 微小管; WAVE; N-WASP; ラメリポディア; Arp2; 3 complex; 膜ラッフリング

アクチン細胞骨格を制御するWASPファミリーのWAVEに結合する蛋白質として酵母two-hybrid法を用いて同定された蛋白質は、N末端にあるFCHドメインにおいて微小管に局在し、またC末端にあるSH3ドメインにおいてN-WASPと結合することが明らかにされた。次に、N-WASPのArp2/3複合体を介したアクチン重合活性にこの蛋白質がどのような影響を与えるのか、精製タンパク質を用いたin vitroのアクチン重合再構成系を用いて解析した。N-WASPはその分子内結合による活性抑制を受けているため、単独ではあまり大きな活性を示さない。そこに精製されたこの蛋白質をN-WASPに加えたところ、その濃度依存的にN-WASPのArp2/3複合体を介したアクチン重合活性は上昇し、最終的にはほぼ最大の活性を示すまでになった。WASPファミリータンパク質は細胞膜の伸展においてArp2/3複合体と共に必須の因子であることが現在までに明らかになっている。このN-WASP結合蛋白質は細胞内でN-WASPの局在を変化させまたin vitroの系においてN-WASPを活性化することから、細胞膜の伸展時にも何らかの機能を果たしていることが推測された。そこでこの蛋白質の野生型、ΔSH3変異体をHeLa細胞内に発現させcell spreading assayを行なってその影響を観察した。この蛋白質は通常細胞内で繊維状の局在を示すが、spreadingしている細胞内では細胞の縁にアクチンと共に局在することが観察された。また、spreadingをしている細胞を固定、観察し、細胞の面積を測定したところΔSH3変異体を発現している細胞は細胞の広がりが抑制されることが明らかになった。以上のことからこの蛋白質はN-WASPのArp2/3複合体を介したアクチン重合活性の活性化因子であり、その活性は細胞膜の伸展に必要であることが示唆された。

发现使用酵母两杂化方法鉴定的蛋白质是一种与调节肌动蛋白细胞骨架的WASP家族结合的蛋白质，发现在N末端的FCH结构域中定位于Microtubule，并在C-terminus的SH3域中与N-WASP结合。接下来，我们使用纯化的蛋白质使用体外肌动蛋白聚合重构系统分析了该蛋白通过N-WASP的ARP2/3复合物分析了该蛋白对肌动蛋白聚合活性的影响。 N-WASP被其分子内结合所抑制，因此不会单独显示出很大的活性。当将纯化的蛋白添加到N-WASP中时，通过N-WASP的ARP2/3复合物以浓度依赖性方式增加了肌动蛋白聚合活性，最终显示出几乎最大的活性。迄今为止，WASP家族蛋白已被证明是细胞膜延伸中的ARP2/3复合物以及ARP2/3复合物的重要因素。这种N-WASP结合蛋白会改变细胞内N-WASP的定位，并激活N-WASP在体外系统中，并推测它在细胞膜延伸过程中也可以执行一些功能。因此，该蛋白的野生型ΔSH3突变体在HeLa细胞中表达，并进行了细胞扩散测定以观察其作用。该蛋白通常显示在细胞中的纤维定位，但是观察到它与肌动蛋白在扩散细胞内的细胞边缘进行定位。此外，当固定并观察到细胞扩散并测量细胞区域时，表达表达ΔSH3突变体的细胞抑制了细胞的扩散。以上表明该蛋白是通过N-WASP的ARP2/3复合物进行肌动蛋白聚合活性的活化剂，其活性是细胞膜延伸所必需的。