アクチン細胞骨格を制御するWAVEの機能解析

控制肌动蛋白细胞骨架的 WAVE 功能分析

基本信息

批准号：
01J06201
负责人：
佐々木信成
金额：
$ 1.92万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2003
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J06201/
关键词：
アクチン微小管 WAVE N-WASP ラメリポディア Arp2 3 complex 膜ラッフリング

项目摘要

アクチン細胞骨格を制御するWASPファミリーのWAVEに結合する蛋白質として酵母two-hybrid法を用いて同定された蛋白質は、N末端にあるFCHドメインにおいて微小管に局在し、またC末端にあるSH3ドメインにおいてN-WASPと結合することが明らかにされた。次に、N-WASPのArp2/3複合体を介したアクチン重合活性にこの蛋白質がどのような影響を与えるのか、精製タンパク質を用いたin vitroのアクチン重合再構成系を用いて解析した。N-WASPはその分子内結合による活性抑制を受けているため、単独ではあまり大きな活性を示さない。そこに精製されたこの蛋白質をN-WASPに加えたところ、その濃度依存的にN-WASPのArp2/3複合体を介したアクチン重合活性は上昇し、最終的にはほぼ最大の活性を示すまでになった。WASPファミリータンパク質は細胞膜の伸展においてArp2/3複合体と共に必須の因子であることが現在までに明らかになっている。このN-WASP結合蛋白質は細胞内でN-WASPの局在を変化させまたin vitroの系においてN-WASPを活性化することから、細胞膜の伸展時にも何らかの機能を果たしていることが推測された。そこでこの蛋白質の野生型、ΔSH3変異体をHeLa細胞内に発現させcell spreading assayを行なってその影響を観察した。この蛋白質は通常細胞内で繊維状の局在を示すが、spreadingしている細胞内では細胞の縁にアクチンと共に局在することが観察された。また、spreadingをしている細胞を固定、観察し、細胞の面積を測定したところΔSH3変異体を発現している細胞は細胞の広がりが抑制されることが明らかになった。以上のことからこの蛋白質はN-WASPのArp2/3複合体を介したアクチン重合活性の活性化因子であり、その活性は細胞膜の伸展に必要であることが示唆された。

使用酵母双杂交方法鉴定出的该蛋白质是与调节肌动蛋白细胞骨架的WASP家族的WAVE结合的蛋白质，定位于N端的FCH结构域和N端的SH3结构域的微管。据透露，它与 N-WASP 结合。接下来，我们使用纯化蛋白的体外肌动蛋白聚合重建系统分析了该蛋白如何通过 Arp2/3 复合物影响 N-WASP 的肌动蛋白聚合活性。由于 N-WASP 的活性受到其分子内键的抑制，因此它本身并没有表现出太多的活性。当将该纯化蛋白添加到N-WASP中时，N-WASP通过Arp2/3复合物的肌动蛋白聚合活性以浓度依赖性方式增加，最终几乎达到最大活性。现已发现WASP家族蛋白与Arp2/3复合物一起是细胞膜延伸的重要因素。由于这种 N-WASP 结合蛋白改变了 N-WASP 在细胞内的定位并在体外系统中激活 N-WASP，因此推断它在细胞膜拉伸过程中也发挥了一些功能。因此，我们在HeLa细胞中表达该蛋白的野生型和ΔSH3突变体，并进行细胞铺展实验来观察其效果。这种蛋白质通常在细胞内显示出丝状定位，但在扩散细胞中，观察到它与肌动蛋白一起定位在细胞边缘。此外，当固定并观察正在扩散的细胞并测量细胞的面积时，发现表达ΔSH3突变体的细胞抑制了细胞扩散。这些结果表明，该蛋白是 N-WASP 通过 Arp2/3 复合物的肌动蛋白聚合活性的激活剂，并且其活性对于细胞膜延伸是必需的。