嫌気性廃水処理における微生物の生態-分子情報を活用した分離困難な微生物の培養-

厌氧废水处理中微生物的生态学 - 利用分子信息难以分离的微生物的培养 -

• 批准号: 01J04157
• 负责人: 井町 寛之
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Nagaoka University of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J04157/
• 关键词: 高温性嫌気性処理; プロピオン酸; 嫌気共生細菌; fluorescence in situ hybridization(FISH); Desulfotomaculum; real-time PCR

本研究は次世代型の省エネルギー・創エネルギー型有機性廃水技術として現在注目を集めている55℃付近で運転する高温嫌気性処理プロセスに着目した。本プロセスは実用化するためにはいくつかの問題を抱えており、特にその運転が不安定になった際にプロピオン酸がプロセス内に著しく蓄積してしまい、良好な処理が望めなくなることが大きな問題の1つである。そこで本研究では、このプロピオン酸の蓄積問題を解決する糸口として、高温嫌気環境下でプロピオン酸を分解する微生物に焦点を当て、その微生物の詳細な菌学的特徴の決定およびプロピオン酸を分解する微生物の多様性の調査および検出・定量方法を確立した。まず、本研究に先立って私が世界に先駆けて分離した高温性嫌気プロピオン酸酸化共生細菌SI株の菌学的特徴の決定を行った。SI株蛛の至適生育温度は55℃であり、至適生育pHは7.0であることを明らかにした。基質利用性試験によりSI株はプロピオン酸以外に乳酸やエタノールなどのアルコール類をMethanothermobacter thermautotrophicus Hとの共生で利用でき、ピルビン酸とフマル酸で単独に生育可能であることを明らかにした。また、SI株の16S rDNAを決定し、分子系統解析を行ったところ、硫酸還元細菌であるDesulfotomaculum属に属することを明らかにした。しかしながら、SI株は硫酸還元能を欠いていること、SI株の持つキノン種はMK-7およびMK-7(H_4)であり、Desulfotomaculum属のそれとは異なること、SI株は硫酸還元の代わりにフマル酸還元をすることが明らかとなった。これらの解析結果から、SI株を新属新種Pelotomaculum thermopropionicumとして提案した。次に上記の解析より得られたSI株の菌学的特徴と新たに16S rRNA遺伝子配列を基に分子系統解析を行った結果から、SI株の属するDesulfotomaculum subcluster Ihグループ硫酸還元能を持たず、分離培養が困難な嫌気共生細菌群で構成されている可能性があるという仮説を立てた。この仮説を検証するために、様々な環境中のDesulfotomaculum subcluster Ihに属する細菌の多様性解析および分離培養等を行った。その結果、嫌気メタン生成環境下では、Desulfotomaculum 属の中でも特にsubcluster Ihに属する細菌が多く存在していることを明らかにし、subcluster Ihに属する新規のプロピオン酸酸化共生細菌を高温性で2株、中温性で3株を培養することに成功した。これらの多様性解析と培養等の結果から、Desulfotomaculum subcluster Ihは嫌気共生細菌で構成され、様々なメタン発酵プロセスに広く存在していることを明らかとなった。さらには、Desulfotomaculum subcluster Ih細菌群を検出・定量を可能にするためにsubclsuter Ih細菌群の16S rRNAを標的としたDNAプローブを作成し、環境中のsubcluster Ih細菌をFISH(fluorescence in situ hybridization)法により検出可能にし、real-time PCR法を用いることで定量方法を確立した。

这项研究的重点是在55℃左右运行的高温厌氧处理工艺，该工艺目前作为下一代节能、创能有机废水技术而备受关注。该工艺在实际应用中存在几个问题，特别是当操作变得不稳定时，丙酸在工艺中大量积累，从而无法期望得到良好的处理，这是问题之一。因此，在本研究中，作为解决丙酸积累这一问题的线索，我们将重点关注在高温厌氧环境下降解丙酸的微生物，确定这些微生物的详细真菌学特征，并分解丙酸。建立了调查、检测和量化微生物多样性的方法。首先，在这项研究之前，我确定了我在世界上首次分离的嗜热厌氧丙酸氧化共生菌株SI的真菌学特征。 SI品系幼崽的最适生长温度为55℃，最适生长pH为7.0。底物利用试验表明，SI菌株除丙酸外，还可以与嗜热甲烷嗜热杆菌H共生，使用乳酸、乙醇等醇类，并且可以在丙酮酸和富马酸上独立生长。此外，我们还测定了SI菌株的16S rDNA并进行了分子系统发育分析，结果表明它属于硫酸盐还原菌Desulfotomaculum属。但SI菌株缺乏还原硫酸盐的能力，SI菌株所拥有的醌种类为MK-7和MK-7(H_4)，与Desulfotomaculum属不同，且SI菌株不还原硫酸盐结果表明，富马酸被还原。基于这些分析结果，SI菌株被提议为新属和新种Pelotomaculum thermopropionicum。接下来，根据上述分析得到的SI菌株的真菌学特征以及基于16S rRNA基因序列的新的分子系统发育分析结果，我们发现SI菌株所属的Desulfotomaculum亚簇Ih群不具有我们推测它可能是由一组难以分离和培养的厌氧共生菌组成。为了验证这一假设，我们对不同环境中属于 Desulfotomaculum 亚群 Ih 的细菌进行了多样性分析和分离培​​养。结果，我们发现在厌氧产甲烷环境中存在许多属于Desulfotomaculum属的细菌，特别是属于Ih亚群的细菌，我们成功地按性别培养了3个菌株。这些多样性分析和培养结果表明，Desulfotomaculum亚群Ih由厌氧共生细菌组成，广泛存在于各种甲烷发酵过程中。此外，为了检测和定量Desulfotomaculum亚群Ih细菌群，我们创建了针对亚群Ih细菌群的16S rRNA的DNA探针，并使用FISH（荧光原位杂交）来检测环境中的亚群Ih细菌。利用该方法使其检测成为可能，并建立了实时荧光定量PCR的定量方法。

项目成果

Chen, A.-C., Imachi, H., Sekiguchi, Y., Ohashi, A., Harada, H.: "Archaeal community composition at different depth(up to 30 m)of a municipal solid waste landfill in Taiwan as revealed by 16S rDNA cloning analyses"Biotechnology Letters. (in press). (2003)

Chen, A.-C.、Imachi, H.、Sekiguchi, Y.、Ohashi, A.、Harada, H.：“台湾城市固体废物填埋场不同深度（最多 30 m）的古菌群落组成为

井町寛之, 関口勇地, 鎌形洋一, 大橋晶良, 原田秀樹: "高温嫌気性廃水処理汚泥から分離したプロピオン酸酸化共生細菌の生理学的特徴とグラニュール汚泥内空間分布"水環境学会誌. 25. 539-546 (2002)

Hiroyuki Imachi、Yuji Sekiguchi、Yoichi Kamagata、Akira Ohashi、Hideki Harada：“从高温厌氧废水处理污泥中分离出的丙酸氧化共生细菌的颗粒污泥内的生理特征和空间分布”日本水环境学会杂志25。 539-546（2002）

Imachi, H., Y.Sekiguchi, Y.Kamagata, S.Hanada, A.Ohashi, H.Harada: "Pelotomaculum thermopropionicum gen. nov., sp. nov., an anaerobic, thermophilic, syntrophic propionate-oxidizing bacterium"International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology. 5

Imachi, H., Y.Sekiguchi, Y.Kamagata, S.Hanada, A.Ohashi, H.Harada：“Pelotomaculum thermopropionicum gen. nov., sp. nov.，一种厌氧、嗜热、互养丙酸氧化细菌”国际

Imachi, H., Y.Sekiguchi, Y.Kamagata, A.Ohashi, H.Harada: "Cultivation and in situ detection of a thermophilic bacterium capable of oxidizing propionate in syntrophic association with hydrogenotrophic methanogens in a thermophilic methanogenic granular slu

Imachi, H., Y.Sekiguchi, Y.Kamagata, A.Ohashi, H.Harada：“在嗜热产甲烷颗粒泥中与氢营养型产甲烷菌互养关联的能够氧化丙酸的嗜热细菌的培养和原位检测

Qiu, Y.-L., Y.Sekiguchi, H.Imachi, Y.Kamagata, I-C.Tseng, S.-S.Cheng, A.Ohashi, H.Harada: "Sporotomaculum syntrophicum sp. nov., a novel anaerobic, syntrophic benzoate-degrading bacteriumisolated from methanogenic sludge treating wastewater from terephtha

Qiu, Y.-L., Y.Sekiguchi, H.Imachi, Y.Kamagata, I-C.Tseng, S.-S.Cheng, A.Ohashi, H.Harada：“Sporotomaculum syntropicum sp. nov.，一种新型厌氧菌