嫌気性廃水処理における微生物の生態-分子情報を活用した分離困難な微生物の培養-

厌氧废水处理中微生物的生态学 - 利用分子信息难以分离的微生物的培养 -

• 批准号: 01J04157
• 负责人: 井町 寛之
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Nagaoka University of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-01J04157/
• 关键词: 高温性嫌気性処理; プロピオン酸; 嫌気共生細菌; fluorescence in situ hybridization(FISH); Desulfotomaculum; real-time PCR

本研究は次世代型の省エネルギー・創エネルギー型有機性廃水技術として現在注目を集めている55℃付近で運転する高温嫌気性処理プロセスに着目した。本プロセスは実用化するためにはいくつかの問題を抱えており、特にその運転が不安定になった際にプロピオン酸がプロセス内に著しく蓄積してしまい、良好な処理が望めなくなることが大きな問題の1つである。そこで本研究では、このプロピオン酸の蓄積問題を解決する糸口として、高温嫌気環境下でプロピオン酸を分解する微生物に焦点を当て、その微生物の詳細な菌学的特徴の決定およびプロピオン酸を分解する微生物の多様性の調査および検出・定量方法を確立した。まず、本研究に先立って私が世界に先駆けて分離した高温性嫌気プロピオン酸酸化共生細菌SI株の菌学的特徴の決定を行った。SI株蛛の至適生育温度は55℃であり、至適生育pHは7.0であることを明らかにした。基質利用性試験によりSI株はプロピオン酸以外に乳酸やエタノールなどのアルコール類をMethanothermobacter thermautotrophicus Hとの共生で利用でき、ピルビン酸とフマル酸で単独に生育可能であることを明らかにした。また、SI株の16S rDNAを決定し、分子系統解析を行ったところ、硫酸還元細菌であるDesulfotomaculum属に属することを明らかにした。しかしながら、SI株は硫酸還元能を欠いていること、SI株の持つキノン種はMK-7およびMK-7(H_4)であり、Desulfotomaculum属のそれとは異なること、SI株は硫酸還元の代わりにフマル酸還元をすることが明らかとなった。これらの解析結果から、SI株を新属新種Pelotomaculum thermopropionicumとして提案した。次に上記の解析より得られたSI株の菌学的特徴と新たに16S rRNA遺伝子配列を基に分子系統解析を行った結果から、SI株の属するDesulfotomaculum subcluster Ihグループ硫酸還元能を持たず、分離培養が困難な嫌気共生細菌群で構成されている可能性があるという仮説を立てた。この仮説を検証するために、様々な環境中のDesulfotomaculum subcluster Ihに属する細菌の多様性解析および分離培養等を行った。その結果、嫌気メタン生成環境下では、Desulfotomaculum 属の中でも特にsubcluster Ihに属する細菌が多く存在していることを明らかにし、subcluster Ihに属する新規のプロピオン酸酸化共生細菌を高温性で2株、中温性で3株を培養することに成功した。これらの多様性解析と培養等の結果から、Desulfotomaculum subcluster Ihは嫌気共生細菌で構成され、様々なメタン発酵プロセスに広く存在していることを明らかとなった。さらには、Desulfotomaculum subcluster Ih細菌群を検出・定量を可能にするためにsubclsuter Ih細菌群の16S rRNAを標的としたDNAプローブを作成し、環境中のsubcluster Ih細菌をFISH(fluorescence in situ hybridization)法により検出可能にし、real-time PCR法を用いることで定量方法を確立した。

这项研究的重点是在55°C左右运行的高温厌氧治疗过程，目前，它作为下一代节能，产生能源的有机废水技术引起了人们的关注。这个过程面临几个问题，以便将其置于实际使用中，主要问题之一是，丙酸在此过程中大大累积了，尤其是当它的运行变得不稳定时，使得无法期待良好的治疗方法。因此，这项研究的重点是在高温厌氧环境中降解普遍酸的微生物，这是解决这种丙酸积累问题的线索，并建立了一种确定这些微生物的详细真菌特征的方法，并研究，检测和量化了微生物的多样性酸的多样性。首先，在这项研究之前，我确定了我以前在世界上分离出的高温厌氧丙酸酯氧化共生细菌的SI菌株的真菌特征。据显示，SI菌株的最佳生长温度为55°C，最佳生长pH值为7.0。底物的可用性测试表明，除丙酸外，SI菌株还可以与甲烷菌的热营养性H共生，并且可以与丙酮酸和富马酸单独生长。此外，确定了Si菌株的16S rDNA，分子系统发育分析表明，它属于去硫酸盐再生细菌的Desulfotomaculum属。然而，有发现SI菌株缺乏硫酸盐的还原能力，Si菌株的喹酮物种是MK-7和MK-7（H_4），它们与Deulfotomaculum属不同，而Si菌株则减少了富马酸的毒酸，而不是硫酸盐还原。基于这些分析结果，我们提出了Si菌株作为新物种pelotomaculum热丙二基蛋白。接下来，基于从上述分析获得的SI菌株的真菌学特征和新的16S rRNA基因序列，我们假设它可以由厌氧共生细菌组成，而厌氧共生细菌没有能力减少硫酸盐，并且难以分离和培养。为了检验这一假设，在各种环境中进行了多样性分析和属于Deulfotomaculum subluster IH的细菌的分离培养。结果，据透露，在厌氧甲烷原中，有许多细菌属于亚簇IH，尤其是在脱硫属中，并且成功地培养了两种新型的丙酸氧化氧化共生细菌菌株，这些菌株属于高温和三种菌株，在高温和三株中。这些多样性分析和培养结果的结果表明，脱硫瘤亚簇IH由厌氧共生细菌组成，并在各种甲烷发酵过程中广泛存在。 Furthermore, in order to enable detection and quantification of the Desulfotomaculum subcluster Ih bacteria group, a DNA probe targeting the 16S rRNA of the subcluster Ih bacteria group was created, and subcluster Ih bacteria in the environment could be detected by FISH (fluorescence in situ hybridization) method, and a quantification method was established by using a real-time PCR method.

项目成果

Chen, A.-C., Imachi, H., Sekiguchi, Y., Ohashi, A., Harada, H.: "Archaeal community composition at different depth(up to 30 m)of a municipal solid waste landfill in Taiwan as revealed by 16S rDNA cloning analyses"Biotechnology Letters. (in press). (2003)

Chen, A.-C.、Imachi, H.、Sekiguchi, Y.、Ohashi, A.、Harada, H.：“台湾城市固体废物填埋场不同深度（最多 30 m）的古菌群落组成为

井町寛之, 関口勇地, 鎌形洋一, 大橋晶良, 原田秀樹: "高温嫌気性廃水処理汚泥から分離したプロピオン酸酸化共生細菌の生理学的特徴とグラニュール汚泥内空間分布"水環境学会誌. 25. 539-546 (2002)

Hiroyuki Imachi、Yuji Sekiguchi、Yoichi Kamagata、Akira Ohashi、Hideki Harada：“从高温厌氧废水处理污泥中分离出的丙酸氧化共生细菌的颗粒污泥内的生理特征和空间分布”日本水环境学会杂志25。 539-546（2002）

Imachi, H., Y.Sekiguchi, Y.Kamagata, S.Hanada, A.Ohashi, H.Harada: "Pelotomaculum thermopropionicum gen. nov., sp. nov., an anaerobic, thermophilic, syntrophic propionate-oxidizing bacterium"International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology. 5

Imachi, H., Y.Sekiguchi, Y.Kamagata, S.Hanada, A.Ohashi, H.Harada：“Pelotomaculum thermopropionicum gen. nov., sp. nov.，一种厌氧、嗜热、互养丙酸氧化细菌”国际

Imachi, H., Y.Sekiguchi, Y.Kamagata, A.Ohashi, H.Harada: "Cultivation and in situ detection of a thermophilic bacterium capable of oxidizing propionate in syntrophic association with hydrogenotrophic methanogens in a thermophilic methanogenic granular slu

Imachi, H., Y.Sekiguchi, Y.Kamagata, A.Ohashi, H.Harada：“在嗜热产甲烷颗粒泥中与氢营养型产甲烷菌互养关联的能够氧化丙酸的嗜热细菌的培养和原位检测

Qiu, Y.-L., Y.Sekiguchi, H.Imachi, Y.Kamagata, I-C.Tseng, S.-S.Cheng, A.Ohashi, H.Harada: "Sporotomaculum syntrophicum sp. nov., a novel anaerobic, syntrophic benzoate-degrading bacteriumisolated from methanogenic sludge treating wastewater from terephtha

Qiu, Y.-L., Y.Sekiguchi, H.Imachi, Y.Kamagata, I-C.Tseng, S.-S.Cheng, A.Ohashi, H.Harada：“Sporotomaculum syntropicum sp. nov.，一种新型厌氧菌