ウシ肝臓のヒスチジノールデヒドロゲナーゼの精製およびその分子生物学的研究

牛肝组氨醇脱氢酶的纯化及其分子生物学研究

基本信息

批准号：
01F00320
负责人：
小野寺良次
金额：
$ 0.64万
依托单位：
University of Miyazaki
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至 2002
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、ウシの肝臓のヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(HLDase)(ヒスチジン合成酵素)を精製して性質を明らかにし、HLDaseのアミノ酸配列を決定し、さらにその塩基配列からオリゴヌクレオチドを合成し、これをプローブとしてウシ肝臓のcDNAライブラリーからHLDase遺伝子をスクリーニングして、HLDase遺伝子の塩基配列を決定することを目的とした。本研究は、平成13年度に採択されたが、外国人特別研究員の都合により、平成13年10月23日から開始した。平成13年度は、ウシ肝臓のHLDaseの精製の第1段階として、粗酵素液の硫安分画により活性を示すタンパク質画分を分画する予定であったが、この第1段階で、他の酵素とは異なり、硫安分画をすると活性が現れなくなることがわかり、まず、その原因を究明した。原因は、硫酸アンモニウムの存在により、高速液体クロマトグラフィーで分析した場合にヒスチジンのピークが消失することであった。硫安分画に代わる有効な手段として、プロタミンとポリエチレングリコール(PEG)を用いることよりHLDase活性を示すタンパク質画分を分画することができた。すなわち、1%硫酸プロタミンを加えて遠心後の上清液に7-18%PEG沈殿画分を集めた。この処理により、HLDaseの比活性は3.2倍になった。また、この酵素は、-80℃に1週間保存すると約15%だけ活性が低下した。L-ヒスチジノールに対するこの酵素のKmおよびVmaxは1.43および0.23mMであった。また、NAD^+に対しては、1.0および0.72mMであった。この酵素活性は、Mn^<2+>により84%だけ活性が高まった。0.5mM Hg^<2+>は、この酵素活性を完全に阻害した。次に、7-18%PEG沈殿画分のNative PAGEを行った結果、HLDase活性を示すバンドが2本現れた。まもなく精製が終了する。

本研究对牛肝组氨醇脱氢酶（HLDase）（组氨酸合酶）进行纯化和表征，确定了HLDase的氨基酸序列，从碱基序列合成了寡核苷酸，本研究的目的是从牛肝中筛选HLDase基因。以肝脏cDNA文库为探针，确定HLDase基因的碱基序列。这项研究于2001年通过，但由于国外特约研究员的情况，于2001年10月23日开始。 2001财年，作为牛肝HLDase纯化的第一步，我们计划通过硫酸铵分级分离粗酶溶液来分离活性蛋白级分，但发现硫酸铵分级分离后活性消失，并且活性蛋白级分消失。第一步是调查其原因。原因是硫酸铵的存在导致高效液相色谱分析时组氨酸峰消失。作为硫酸铵分级分离的有效替代方法，我们能够使用鱼精蛋白和聚乙二醇 (PEG) 来分级显示 HLDase 活性的蛋白质级分。即，加入1％硫酸鱼精蛋白，离心后在上清液中收集7-18％PEG沉淀级分。这种处理使 HLDase 的比活性增加了 3.2 倍。此外，在-80°C保存1周后，该酶的活性降低了约15%。该酶对 L-组氨醇的 Km 和 Vmax 分别为 1.43 和 0.23 mM。此外，对于 NAD^+，浓度为 1.0 和 0.72mM。 Mn 2+ 使该酶活性增加84％。 0.5mM Hg 2+ 完全抑制该酶活性。接下来，7-18% PEG沉淀级分的非变性PAGE结果，出现了两条表明HLDase活性的条带。炼制工作很快就会完成。