遺伝子治療用インテリジェント・リポソームシステムの開発

基因治疗智能脂质体系统的研制

基本信息

批准号：
12877188
负责人：
柳衛宏宣
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Teikyo University (2001)The University of Tokyo (2000)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

我々は、難治性癌細胞に癌抑制遺伝子を導入し、癌の悪性度を低く変化させたうえで、集学的治療(外科手術を中心に化学療法、放射線療法、免疫療法の併用)を加味して癌の根絶を図りたいと考えており、ウイルスに代わる遺伝子導入用ベクターの開発を行っている。1.新規Lipoplex(Quarternary complex,Qplex)の開発:我々はCationic liposomeとplasmid DNAとの複合体いわゆLipoplexにprotamineおよびLigandとしてtransferrin(TF)を添加した4成分からなる複合体(Quarternary complex,Qplex)を開発した。Qplexの粒子径は動的光散乱法により258.6±88nmであり、Lipoplex(865±655nm)よりも粒子径が小さい均一な複合体を形成している。Plasmid DNAはβ-galactosidaseをコードしたものを用い、X-gal染色法で発現を調べた。AsPC-1細胞において接触時間2時間では15.4%の細胞に発現が見られたのに対し、4時間では44.2%、8時間では64.7%と、時間と共に発現効率が増加した。また、Lipoplex(1.8%)およびLipoplexにprotamine(8.6%)またはTFのみを添加した複合体(2.6%)に比べて、QpIexはいずれの細胞に対しても著しく高い発現を示した(64.7%)。さらにQplexは血清存在下で酵素活性、発現効率ともに高い値を示すことが分った。2.JTS-1 fusogenic peptideを用いた遺伝子導入効率の増強:インフルエンザウイルス内の融合ペプチドを用いて、内封型のlipoplex:LPDにおいてplasmid DNA、protamine、JTS-1を混合することによりLPD/JTS-1複合体を調整した。Lipoplexに比較してLuciferase assayでは導入する癌細胞により1000倍から10000倍の導入効率の増加をin vitoroで認めた。3.C型肝炎ウイルス細胞障害領域の同定:肝細胞癌の主な原因の一つであるC型肝炎ウイルスの中に細胞障害を引き起こす領域を同定し、この領域には、アポトーシスを引き起こし肝細胞を死に至らしめる作用と核染色体異常をおこす作用がある事を見いだした。この領域のplasmid DNAを腫瘍細胞内に導入すると、FACSおよびPI/Anexin V蛍光染色によりアポトーシスを誘発し抑制効果があることが分かった。LPD/JTS-1複合体を用いることにより、導入効率を増強できることがわかった。

我们将抑癌基因引入难治性癌细胞中，以降低癌症的恶性程度，然后加上多学科治疗（主要是手术结合化疗、放射治疗和免疫治疗），我们希望通过这种方法来根除癌症。开发可以替代病毒的基因转移载体。 1. 开发新型Lipoplex（Quarternary 复合物，Qplex）：我们开发了一种由四种成分组成的复合物（Quarternary 复合物，Qplex），它是阳离子脂质体和质粒DNA的复合物，即所谓的Lipoplex，其中添加了鱼精蛋白和转铁蛋白（TF）作为配体被开发出来。通过动态光散射测定Qplex的粒径为258.6±88 nm，形成均匀的复合材料，其粒径比Lipoplex (865±655 nm)更小。使用编码β-半乳糖苷酶的质粒DNA，并使用X-gal染色检查表达。在AsPC-1细胞中，当接触时间为2小时时，在15.4%的细胞中观察到表达，而表达效率随着时间的推移而增加，在4小时时达到44.2%，在8小时时达到64.7%。此外，与 Lipoplex (1.8%) 和仅向 Lipoplex 添加鱼精蛋白 (8.6%) 或 TF 的复合物 (2.6%) 相比，QpIex 在所有细胞中表现出显着更高的表达 (64.7%)。此外，还发现 Qplex 在血清存在的情况下，酶活性和表达效率都表现出很高的值。 2.使用JTS-1融合肽增强基因转移效率：使用流感病毒内的融合肽，可以通过将质粒DNA、鱼精蛋白和JTS-1混合在封装的lipoplex:LPD -1复合物中来实现LPD/JTS。调整。与 Lipoplex 相比，荧光素酶检测显示转染效率提高了 1000 至 10,000 倍，具体取决于体外引入的癌细胞。 3.丙型肝炎病毒细胞损伤区域的鉴定：我们鉴定了丙型肝炎病毒中引起细胞损伤的区域，它是导致肝细胞癌的主要原因之一，发现它具有导致死亡和核染色体的作用。紊乱 etc。当该区域的质粒 DNA 被引入肿瘤细胞时，FACS 和 PI/Anexin V 荧光染色表明它诱导并抑制了细胞凋亡。结果发现，使用LPD/JTS-1复合物可以提高引入效率。