生物の新規鉄結合蛋白質を介した酸素耐性機構の解明

阐明活体中新型铁结合蛋白介导的氧耐受机制

基本信息

批准号：
12876016
负责人：
神尾好是
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

Dpr分子がどのように酸素耐性を付与しているか明らかとするため、dpr遺伝子産物の取得と解析を行った。好気的に培養したS.mutansの菌体約10gから、精製度で約50倍、精製標品として約2.4mgのDpr蛋白質を得た。Dpr分子は、SDS-PAGEで20kDa、沈降平衡法で223kDaを示し、12量体からなる複合体を形成していた。また、Dpr分子は電子顕微鏡で図1に示したような直径約10nMの球状の粒子として観察され、鉄結合蛋白質であるFerritin(直径12.5nM)と類似した形状であった。ICP-MASSを用いて、金属元素種の同定と定量を行った結果、精製したDpr分子には複合体当たり鉄と亜鉛がそれぞれ27.8、10.5個含まれていた。さらに、その最大積載量を推定したところ、鉄が複合体当たり480個、亜鉛が9.6個であった。Dprはそのアミノ酸の相同性からDpsファミリーに属する蛋白質であると考えられる。そこで大腸菌のDps報告されているDNAとの結合能についてDpr分子でも検討したが、DNAとの結合能は認められなかった。また、抗酸化酵素活性である、SOD活性とカタラーゼ活性についても検討したが、いずれの活性も検出されなかった。以上の結果から、Dpr分子はいわゆるFerritinのよつな鉄結合蛋白質の一種であると考えられた。鉄イオンは、フェントン反応(H2O2+Fe2+→・OH+OH_<->+Fe3+)で知られるように、最も反応性の高い活性酸素種であるヒドロキシルラジカル(・OH)の生成を触媒する。従って、推定されるDpr分子の機能は、生体内の遊離の鉄イオンのキレート作用によるヒドロキシルラジカルの生成抑制である。そこで、Dpr分子が鉄イオンに依存したヒドロキシルラジカルの生成を抑制しうるかどうかin vitroの実験系を用い検討した。その結果、10mMのFe2_+の添加によって引き起こされるヒドロキシルラジカルの産生をDpr分子は非常に効果的に抑制しうることが明らかとなった。

为了阐明DPR分子如何赋予氧耐受性，并获得了DPR基因产物并分析。从大约10 g的有氧培养的链球菌细胞中，以纯化的制剂的形式获得了约50倍的纯化度和约2.4 mg的DPR蛋白。 DPR分子通过SDS-PAGE表现出20 kDa，通过降水平衡表现出223 kDa，形成了一个由12个组成的复合物。此外，DPR分子被视为球形颗粒，直径约为10 nm，如图3所示。 1通过电子显微镜，其形状与铁结合蛋白铁蛋白（直径为12.5 nm）相似。使用ICP质量鉴定并定量金属元素物种，并且每个复合物分别纯化的DPR分子分别包含27.8和10.5铁和锌。此外，当估计最大载荷能力时，每个复合材料和9.6个锌块有480块。由于其氨基酸同源性，DPR被认为是属于DPS家族的蛋白质。因此，还检查了DPR分子的结合能力，该结合能力用DNA报道的DPS进行了大肠杆菌的结合能力，但未发现DNA的结合能力。此外，还研究了抗氧化酶活性，SOD活性和过氧化氢酶活性，但未检测到这些活性。基于上述结果，人们认为DPR分子是一种铁结合蛋白，它是一种所谓的铁蛋白。铁离子催化羟基自由基（.OH）的形成，这是最具活性氧，如芬顿反应中所知（H2O2+Fe2+→・ oh oh+OH _ <->+fe3+）。因此，DPR分子的推定功能是通过体内游离铁离子的螯合抑制羟基自由基的形成。因此，我们使用体外实验系统研究了DPR分子是否可以抑制依赖铁离子的羟基自由基的形成。结果，揭示了DPR分子可以非常有效地抑制由于添加10 mM Fe2_+引起的羟基自由基的产生。