生物の新規鉄結合蛋白質を介した酸素耐性機構の解明

阐明活体中新型铁结合蛋白介导的氧耐受机制

基本信息

批准号：
12876016
负责人：
神尾好是
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

Dpr分子がどのように酸素耐性を付与しているか明らかとするため、dpr遺伝子産物の取得と解析を行った。好気的に培養したS.mutansの菌体約10gから、精製度で約50倍、精製標品として約2.4mgのDpr蛋白質を得た。Dpr分子は、SDS-PAGEで20kDa、沈降平衡法で223kDaを示し、12量体からなる複合体を形成していた。また、Dpr分子は電子顕微鏡で図1に示したような直径約10nMの球状の粒子として観察され、鉄結合蛋白質であるFerritin(直径12.5nM)と類似した形状であった。ICP-MASSを用いて、金属元素種の同定と定量を行った結果、精製したDpr分子には複合体当たり鉄と亜鉛がそれぞれ27.8、10.5個含まれていた。さらに、その最大積載量を推定したところ、鉄が複合体当たり480個、亜鉛が9.6個であった。Dprはそのアミノ酸の相同性からDpsファミリーに属する蛋白質であると考えられる。そこで大腸菌のDps報告されているDNAとの結合能についてDpr分子でも検討したが、DNAとの結合能は認められなかった。また、抗酸化酵素活性である、SOD活性とカタラーゼ活性についても検討したが、いずれの活性も検出されなかった。以上の結果から、Dpr分子はいわゆるFerritinのよつな鉄結合蛋白質の一種であると考えられた。鉄イオンは、フェントン反応(H2O2+Fe2+→・OH+OH_<->+Fe3+)で知られるように、最も反応性の高い活性酸素種であるヒドロキシルラジカル(・OH)の生成を触媒する。従って、推定されるDpr分子の機能は、生体内の遊離の鉄イオンのキレート作用によるヒドロキシルラジカルの生成抑制である。そこで、Dpr分子が鉄イオンに依存したヒドロキシルラジカルの生成を抑制しうるかどうかin vitroの実験系を用い検討した。その結果、10mMのFe2_+の添加によって引き起こされるヒドロキシルラジカルの産生をDpr分子は非常に効果的に抑制しうることが明らかとなった。

进行了DPR基因产物的采集和分析，以找出DPR分子如何产生抗氧。从珍惜的S.Mutan的细菌中，DPR蛋白的纯化约50倍，纯化的纯化靶标的约50倍。 DPR分子在SDS-PAGE中显示20kDa，沉积平衡方法中的223KDA显示，形成了由12个身体组成的复合物。如图2所示，将DPR分子视为直径约为10 nm的球形颗粒。使用ICP-MAS来识别和量化金属元素物种，纯化的DPR分子包含27.8和10.5的铁和10.5块铁和锌。此外，当估计最大载荷能力时，每个复合物有480枚熨斗和9.6锌。由于氨基酸的家乡，DPR被认为是属于DPS家族的蛋白质。因此，检查了DPR分子与DNA的结合能力，该结合能力是由大肠杆菌报告的DPS，但不允许DNA结合。我们还检查了SOD活性和过氧化氢酶活性，这些活性是抗氧化活性，但未检测到活性。从上述结果中，DPR分子被认为是铁结构蛋白的一种被称为的铁蛋白。铁离子是生产羟基自由基（OH）的催化性，这是最具反应性活性氧的催化作用，这是芬顿反应（H2O2+Fe2+→OH+OH_______ <->+Fe3+）所知。因此，估计的DPR分子的功能是通过生物中游离铁离子的螯合作用产生羟基自由基。因此，我们检查了体外实验系统是否可以抑制依赖铁离子的羟基自由基的产生。结果，揭示了DPR分子可以非常有效地抑制由于添加10mm Fe2_+引起的羟基自由基的产生。