変異Ki-Rasにより発現制御される新規がん関連遺伝子の単離機能解析

突变型 Ki-Ras 调控表达的新型癌症相关基因的分离和功能分析

基本信息

批准号：
12213102
负责人：
白澤専二
金额：
$ 3.46万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12213102/
关键词：
Ki-ras 大腸がん epiregulin 遺伝子欠損マウス Mig-6 p53 がん関連遺伝子

项目摘要

大腸癌発症に深く関与する変異Ki-Rasにより発現・制御される遺伝子の同定・機能解析およびシグナル伝達について解析し、がん発生における変異Ki-Rasの意義を解明することを目的とする。1)膜結合型増殖因子であるepiregulinが大腸癌細胞株HCT116においては、変異Ki-Rasにより発現誘導されることを見出し、その発がんに及ぼす影響をHCT116細胞の変異Ki-rasを特異的に欠失させたHKe3細胞にepiregulinを強制発現する系を樹立し、epiregulinが腫瘍原性に重要な役割を果たしていることを示した。2)マウスepiregulinのgenomic DNAを単離し、coding regionをほぼ全欠損させるコンストラクトを作製し、定型通りにキメラマウスを樹立し、最終的にepiregulin欠損マウスを樹立した。3)変異Ki-Rasにより発現制御される遺伝子としてSept(Strong Expression Observed in Pancreas and Tumors)を単離し、機能解析を行った。SeptのC末にHAタグを付加して、COS7細胞にTransient Transfectionを行い、共焦点レーザー顕微鏡による解析を行った結果、Septの一部がミトコンドリアに局在すること、又Septの発現している細胞のミトコンドリアの膜電位が低下することを見出した。4)マウスgenomic libraryよりSeptのgenomic cloneを単離し、exon-intron構造を決定した。更に、その情報を基に遺伝子欠損マウス作製のためのコンストラクトを作成した。5)Mig-6をbaitとして、ヒト肝臓cDNAライブラリーに対して、酵母Two Hybrid法により会合する分子をスクリーニングした結果、Ring Fingerドメインを持つMigBP#3を同定した。6)Rasからのシグナルが、ERKの経路を通じて、Mdm2の発現およびp19ARFの発現を誘導し、更にp19ARFが存在しない場合にはDNA障害性刺激によるp53の蓄積がRasのシグナルにより抑制されることを示した。

本研究的目的是对突变型Ki-Ras表达和调控的基因进行鉴定和功能分析，这些基因与结直肠癌的发生发展密切相关，并对信号转导进行分析，阐明突变型Ki-Ras的意义。 Ras在癌症发展中的作用。 1）我们发现结直肠癌细胞系HCT116中突变型Ki-Ras可诱导膜结合生长因子上皮调节蛋白的表达，并通过HCT116细胞中特异缺失突变型Ki-ras来研究其对致癌作用的影响我们建立了一个系统，其中上皮调节蛋白在耗尽的 HKe3 细胞中强制表达，并证明上皮调节蛋白在致瘤性中发挥重要作用。 2）我们分离了小鼠上皮调节蛋白的基因组DNA，构建了几乎整个编码区删除的构建体，按照标准程序建立了嵌合小鼠，最终建立了上皮调节蛋白缺陷小鼠。 3)我们分离出Sept（在胰腺和肿瘤中观察到强表达）作为其表达受突变Ki-Ras调节的基因，并进行了功能分析。通过在 Sept 的 C 末端添加 HA 标签对 COS7 细胞进行瞬时转染，并使用共聚焦激光显微镜分析显示 Sept 的一部分位于线粒体中，并且我们发现 Sept 的线粒体膜电位有表达。细胞减少。 4)我们从小鼠基因组文库中分离出Sept基因组克隆并确定其外显子-内含子结构。此外，根据这些信息，我们创建了一种用于生产基因缺陷小鼠的构建体。 5) 以Mig-6为诱饵，利用酵母二杂交法筛选与人肝脏cDNA文库相关的分子，结果鉴定出具有环指结构域的MigBP#3。 6)来自Ras的信号通过ERK途径诱导Mdm2和p19ARF的表达，此外，在没有p19ARF的情况下，由DNA损伤刺激引起的p53的积累被Ras信号抑制。