変異Ki-Rasにより発現制御される新規がん関連遺伝子の単離機能解析

突变型 Ki-Ras 调控表达的新型癌症相关基因的分离和功能分析

基本信息

批准号：
12213102
负责人：
白澤専二
金额：
$ 3.46万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12213102/
关键词：
Ki-ras 大腸がん epiregulin 遺伝子欠損マウス Mig-6 p53 がん関連遺伝子

项目摘要

大腸癌発症に深く関与する変異Ki-Rasにより発現・制御される遺伝子の同定・機能解析およびシグナル伝達について解析し、がん発生における変異Ki-Rasの意義を解明することを目的とする。1)膜結合型増殖因子であるepiregulinが大腸癌細胞株HCT116においては、変異Ki-Rasにより発現誘導されることを見出し、その発がんに及ぼす影響をHCT116細胞の変異Ki-rasを特異的に欠失させたHKe3細胞にepiregulinを強制発現する系を樹立し、epiregulinが腫瘍原性に重要な役割を果たしていることを示した。2)マウスepiregulinのgenomic DNAを単離し、coding regionをほぼ全欠損させるコンストラクトを作製し、定型通りにキメラマウスを樹立し、最終的にepiregulin欠損マウスを樹立した。3)変異Ki-Rasにより発現制御される遺伝子としてSept(Strong Expression Observed in Pancreas and Tumors)を単離し、機能解析を行った。SeptのC末にHAタグを付加して、COS7細胞にTransient Transfectionを行い、共焦点レーザー顕微鏡による解析を行った結果、Septの一部がミトコンドリアに局在すること、又Septの発現している細胞のミトコンドリアの膜電位が低下することを見出した。4)マウスgenomic libraryよりSeptのgenomic cloneを単離し、exon-intron構造を決定した。更に、その情報を基に遺伝子欠損マウス作製のためのコンストラクトを作成した。5)Mig-6をbaitとして、ヒト肝臓cDNAライブラリーに対して、酵母Two Hybrid法により会合する分子をスクリーニングした結果、Ring Fingerドメインを持つMigBP#3を同定した。6)Rasからのシグナルが、ERKの経路を通じて、Mdm2の発現およびp19ARFの発現を誘導し、更にp19ARFが存在しない場合にはDNA障害性刺激によるp53の蓄積がRasのシグナルにより抑制されることを示した。

目的是识别和分析由突变体Ki-Ras表达和调控的基因的功能分析，该基因与结肠癌的发展深深相关，并阐明了突变Ki-Ras在癌症发展中的重要性。 1) We found that epiregulin, a membrane-bound growth factor, is expressed by mutant Ki-Ras in the colon cancer cell line HCT116, and the effect of its on carcinogenicity was established to forcibly express epiregulin in HKe3 cells that have specifically deleted the mutant Ki-ras in HCT116 cells, indicating that epiregulin plays an important role in tumorigenicity. 2）分离了小鼠环蛋白的基因组DNA，并制备了几乎完全缺乏编码区域，像往常一样建立嵌合小鼠，并最终建立了嵌合小鼠。 3）SEPT（在胰腺和肿瘤中观察到的强表达）被分离为通过突变Ki-Ras表达的基因，并进行了功能分析。将SEPT的C末端添加到SEPT的C端，并对COS7细胞进行短暂转染，并使用共聚焦激光显微镜进行分析。我们发现SEPT的一部分位于线粒体上，并且降低了表达SEPS的细胞的膜电位。 4）从小鼠基因组文库中分离出SEPT基因组克隆，并确定外显子内结构。此外，基于此信息，创建了用于产生基因缺陷小鼠的结构。 5）在使用MIG-6作为诱饵的人肝cDNA文库筛选分子后，我们确定了具有环手指域的MigBP＃3。 6）来自RAS的信号通过ERK途径诱导MDM2和P19ARF的表达，并进一步表明，在没有P19ARF的情况下，RAS信号抑制了由于DNA损伤刺激而导致的p53积累。