高機能チップを用いたプロテオーム解析システムの構築

利用高性能芯片构建蛋白质组分析系统

• 批准号: 12202055
• 负责人: 福沢 世傑
• 金额: --
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12202055/
• 关键词: プロテオーム; チップ; 混合自己組織化膜; SH3ドメイン; MALDI; TOF; スクリーニング

平滑なガラス表面に金を真空蒸着した基板上に、末端にSH基を導入したC11のアルキル鎖とPEGからなる自己組織化膜を貼り付けた。PEG末端のOH基で覆われた基板表面は、デキストランコートを施したものよりも非特異的吸着が低いことが報告されており、単分子膜の構成成分を短鎖(エチレングリコール3単位(EG=3))と長鎖(EG=6)の両方で構成し、長鎖のみを各種官能基で活性化した。立体障害を避けるように2:98の比率で比率で混合した長鎖と不活性な短鎖(末端はOH基)からなる混合自己組織化膜を金表面上に形成させた。基板表面は一定の密度で官能基がすべて同じ方向を向いているので、高い確率で特異的に相互作用するものを補足することが期待される。本年度では上記のモデルシステムとしてPI3KのSH3ドメインとリガンドペプチドを選び、リガンドペプチドを固定したもの、長鎖の末端をNH2基で修飾したもの、末端がOH基のみのもの、そして無修飾の金チップの4種を用意し、PI3K-SH3ドメインの溶液をのせてインキュベーションし、水で一回のピペッティングで洗浄と脱塩を同時に行い、MALDI/TOF-MS型質量分析計でイオン化したところリガンドペプチドチップに強いPI3K-SH3ドメインのイオンピークが観測された。他にOHチップに僅かにイオンピークが観測されるのみであった。また一回のスクリーニングに消費したタンパク質は25μMの濃度で2μLすなわち50pmolで可能であることも示している。実際はその9割以上を回収できたので実質的な消費量はそれ以下である。

将末端引入SH基团的C11烷基链和PEG组成的自组装薄膜粘贴到光滑玻璃表面真空沉积金的基底上。据报道，PEG末端覆盖有OH基团的基材表面比涂有葡聚糖=3））和长链（EG=6）的基材表面具有更低的非特异性吸附，并且仅长链被活化。具有各种官能团。在金表面形成了由长链和惰性短链（以 OH 基团终止）以 2:98 的比例混合组成的混合自组装膜，以避免空间阻碍。由于基材表面具有恒定的密度并且所有官能团都沿相同方向取向，因此预计它们将以高概率捕获那些与它们特异性相互作用的官能团。今年，我们选择了PI3K的SH3结构域和配体肽作为上述模型系统，一种是固定配体肽，一种是长链末端修饰有NH2基团，一种是末端只有一个OH基团，和未修改的金芯片有 4 种类型：PI3K-SH。与三个结构域的溶液一起温育后，通过移液一次同时进行水洗和脱盐，并使用MALDI/TOF-MS质谱仪进行电离，结果表明PI3K-SH3结构域离子对配体肽芯片A具有很强的抵抗力。观察到峰值。此外，在 OH 芯片上仅观察到少数离子峰。还表明，一次筛选消耗的蛋白质量在25 μM浓度下可以为2 μL或50 pmol。事实上，90%以上都被回收了，所以实际消耗的量比这个少。