高機能チップを用いたプロテオーム解析システムの構築

利用高性能芯片构建蛋白质组分析系统

• 批准号: 12202055
• 负责人: 福沢 世傑
• 金额: --
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (C)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12202055/
• 关键词: プロテオーム; チップ; 混合自己組織化膜; SH3ドメイン; MALDI; TOF; スクリーニング

平滑なガラス表面に金を真空蒸着した基板上に、末端にSH基を導入したC11のアルキル鎖とPEGからなる自己組織化膜を貼り付けた。PEG末端のOH基で覆われた基板表面は、デキストランコートを施したものよりも非特異的吸着が低いことが報告されており、単分子膜の構成成分を短鎖(エチレングリコール3単位(EG=3))と長鎖(EG=6)の両方で構成し、長鎖のみを各種官能基で活性化した。立体障害を避けるように2:98の比率で比率で混合した長鎖と不活性な短鎖(末端はOH基)からなる混合自己組織化膜を金表面上に形成させた。基板表面は一定の密度で官能基がすべて同じ方向を向いているので、高い確率で特異的に相互作用するものを補足することが期待される。本年度では上記のモデルシステムとしてPI3KのSH3ドメインとリガンドペプチドを選び、リガンドペプチドを固定したもの、長鎖の末端をNH2基で修飾したもの、末端がOH基のみのもの、そして無修飾の金チップの4種を用意し、PI3K-SH3ドメインの溶液をのせてインキュベーションし、水で一回のピペッティングで洗浄と脱塩を同時に行い、MALDI/TOF-MS型質量分析計でイオン化したところリガンドペプチドチップに強いPI3K-SH3ドメインのイオンピークが観測された。他にOHチップに僅かにイオンピークが観測されるのみであった。また一回のスクリーニングに消費したタンパク質は25μMの濃度で2μLすなわち50pmolで可能であることも示している。実際はその9割以上を回収できたので実質的な消費量はそれ以下である。

由C11烷基链和PEG制成的自组装膜在末端引入了SH组，被粘贴到一个基板上，将金真空沉积在光滑的玻璃表面上。据报道，PEG末端覆盖的OH组覆盖的底物表面的吸附较低，其吸附量低于被右旋涂层的底物，而单层组件由两个短链组成（两个短链（3个单位）组成（乙烯乙二醇单位（EG = 3））和长链（例如，只有长的链条（例如6），并且只有多个链构成了各种功能。混合的自组装膜由长链和惰性短链（终端OH组）组成，以2:98的比例混合，以避免在金表面上形成空间障碍。由于底物表面一直处于恒定密度，因此所有官能团都指向相同的方向，因此预计补充特定相互作用的概率很高。在今年，选择了四种类型的PI3K SH3结构域和配体肽作为上述模型系统，并准备了配体肽：那些具有固定配体肽的肽，那些具有长链末端的NH2基团，仅在末端的OH组的长链末端的肽，以及那些末端的OH组，以及那些具有无效金芯片的人。将PI3K-SH3结构域的溶液放置在PI3K-SH3域的顶部，并用一个用水将混合物洗涤并脱水，并用MALDI/TOF-MS型质谱仪离子将PI3K-SH3结构域的离子峰离电离，观察到了PI3K-SH3域的ION峰值，可抵抗对Ligand peptide peptedide peptedide Chips的抵抗。其他仅在OH芯片上观察到少量的离子峰。它还表明，在25μm或50 pmol的浓度下，在单个筛选中消耗的蛋白质可能会消耗。实际上，其中有90％以上被恢复了，因此实际消费少于此。